实验一、RNA提取和检测.pptVIP

实验 一、RNA提取及检测;;四、实验步骤 采用Trizol法提取RNA(50－100mg组织∕ml trizol)，以加1ml Trizol为例，操作流程如下： (1) 研钵加液氮数次至足够冷，加入样品，研磨至粉末。加入Trizol（每100mg组织加1ml的Trizol），充分研磨，放在室温下解冻。 (2) 除不溶性物质：2～8oC下12000g离心10min，不溶性物质沉淀，将RNA的上清移入1.5 ml离心管中。 (3)相分离：在15～30℃下放置5min，使核蛋白复合物完全解离。加0.2ml氯仿，剧烈振荡15 sec，室温下温浴2～3min。2～8℃下，≤12000g离心15min，RNA全部溶解于上层水相中，把水相移入另一1.5ml离心管中。 ;(4) 氯仿再次去杂：加0.5ml氯仿，剧烈振荡15sec，室温下温浴2～3min；2～8℃下，≤12000g离心15min，把水相转入1.5ml离心管中。 (5) RNA沉积：加入0.5ml异丙醇，15～30℃温浴10min；2-8℃下，≤12000g离心10min，RNA沉积在离心管的底部及侧壁。 (6)清洗RNA：加入1ml 75%乙醇，2～8℃下≤7500g离心5min，小心将上清液倒掉。 (7)再清洗：加入1ml 75%乙醇，2～8℃下，≤7500g离心5min，小心将上清液倒掉。 (8)RNA的溶解：将离心管倒扣在吸水纸上5～10min，每管加30μl的DEPC水，可在55～60℃下助溶10min。;(9)RNA浓度：用DEPC水稀释100倍，用紫外分光光度计 测定OD值（260nm、280nm 230nm），估算RNA浓度。-70 ℃保存。 总RNA定量方法? RNA在260nm波长处有最大吸收峰。OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径，用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000?;;;（2）RNA电泳结果判别质量： 出现的电泳条带有两条，是两条最大的核糖体RNA（rRNA）分子，即18S 和28S rRNA，较小的RNA也很丰富但看不到，因为太小，跑出了凝胶的边界。多数细胞中的信使RNA（mRNA）经EB染色后不足以形成可见的带。只要18S 和28SrRNA带亮，且28S rRNA大约为18S rRNA 的两倍，说明提取的RNA没有发生降解，纯度好。;五、总RNA提取常见问题分析; OD260/OD280比值偏低1. 蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。2.苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。3.多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。4.设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。 ;RNA提取得率低1. 该组织或者细胞中RNA含量偏低： 不同细胞和组织中RNA的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏等是高丰度组织(总RNA含量2-4μg/mg)，脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢等是中丰度组织(总RNA含量0.05-2μg/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低丰度组织(总RNA含量0.05μg/mg)。2. 组织起始量太少或者太多： 样品量过少，则细胞组织中RNA含量较低；样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力，裂解将不完全，从而导致RNA得率低。 六、注意事项：1．所有实验过程均须避免Rnase的污染。2．要避免沉淀完全干燥，否则RNA难??溶解。3.样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。