病毒包装与感染讲解.ppt

; 基因载体系统;基本概念：即病毒载体介导基因技术，一种高效的基因转移工具，将外源基因包装到天然病毒的外壳中，利用病毒对宿主细胞的感染性，将外源基因导入特定细胞中，广泛应用于基因诊断和基因治疗。;病毒载体的优势;存在的问题;;;;?;腺病毒载体 ;腺病毒系统的包装;慢病毒载体;慢病毒载体的特性; ;HIV-1;慢病毒载体系统组成;表达载体部分与包装成分互补,仅含有包装、逆转录和整合所需的HIV-1顺式作用元件, 5’端LTR和全部5’端非翻译区域。 包膜表达质粒使用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用来代替了原病毒的env基因。;三代慢病毒载体;lentivirus 包装流程;逆转录病毒载体;逆转录病毒载体的特点;;逆转录病毒载体包装原理; ;第一代包装细胞 基因组整合了仅缺失包装信号的MLV前病毒基因组，包装的病毒颗粒为单嗜性。 将其包膜蛋白env基因换成鼠4070A病毒的双嗜???包膜蛋白，就产生了能分泌双嗜性病毒的包装细胞。但这个细胞系所含的包装结构仅仅缺失Ψ信号，只要它们与载体之间发生一次重组，就可以产生有复制能力的野生型病毒，安全性很差。 第二代包装细胞 前病毒基因组除了包装信号缺失外，5’LTR的5’端顺序也缺失，病毒剪接供体上游部位进一步缺失，3’LTR被SV40的转录终止多聚腺苷酸信号取代。经过这样的改造，包装细胞与载体系列之间的共同顺序只存在于紧接gag起始密码子上游53bp的区域。; 这种包装结构与载体结构至少经过二次独立的重组才能形成有复制能力的野生型病毒，使基因治疗的安全性大大提高。但如用早期的载体进行包装，经长期培养后，仍有野生型病毒产生。 第三代包装细胞 几乎将基因载体和包装细胞间重组产生的野生型病毒完全消除。包装细胞含有二个互补的逆转录病毒基因组，二者均缺失包装信号，且3’LTR均被SV40的多聚腺苷酸化信号取代。但其中一个包装结构只含gag和pol基因，另一结构只含有env基因，由二者联合产生的蛋白质供载体包装。这类包装细胞具有更高的安全性。;常见的包装细胞系 ;目前常用逆转录病毒表达系统的构成： 一个含有目的基因的逆转录病毒表达载体；一个包膜蛋白载体；表达 gag/pol 的辅助质粒；以及包装细胞系。 表达载体： 去除了野生型病毒颗粒形成所必需的结构基因，其基本结构和特点为： (1) 5’LTR为CMV/MSV杂合启动子，缺失一段序列的3’LTR作为终止子，不会在体内发生重组； (2) 保留包装信号ψ+序列,促进高滴度病毒产生。； (3) 去除了野生型病毒颗粒形成所必需的结构基因，保证载体使用的安全性； (4) 在目的基因后用内部核糖体进入位点连接抗性基因，可以根据需要选择不同的抗性； (5) 重组病毒基因组的大小不能超过10kb，如果太大则无法包装成病毒。; 包膜蛋白载体 逆转录病毒的宿主范围由病毒颗粒表面的包膜蛋白(Env)决定，病毒基因组不影响其靶向性，不同的基因组可用相同的Env包被，且Env来自何种病毒，包装出的病毒颗粒就叫该病毒的假病毒。 逆转录病毒的包膜蛋白如10A1、GAP70和4070A等都不稳定，其与细胞受体的结合部位容易受离心剪切力或其它机械力破坏。此外，由这些包膜蛋白参与组成的逆转录病毒在进入宿主细胞时需要经过一个特异性的受体配体结合过程，由此决定了一种病毒只能感染一种或一类细胞，限制了逆转录病毒表达系统的应用。 包膜蛋白常用的载体主要有P10A1、pEco、pAmpo和口炎疱疹病毒-G蛋白（vesicular stomatitis virus G, VSV-G）。;VSV-G因其具有更广泛的宿主范围和更高的转染效率等优点而成为组成逆转录病毒表达系统的最常用包膜蛋白载体。 VSV-G的结构比较简单，在与逆转录病毒载体共转染到包装细胞内之后，VSV-G蛋白瞬时表达，调节病毒通过脂质结合及质膜融合，介导病毒进入细胞，将重组病毒RNA包装成有感染力的病毒。;当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配，该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。;逆转录病毒包装流程;1）构建逆转录病毒载体：将目的基因片段连接至逆转录病毒载体； 2）包装细胞准备和病毒包装 将293T 细胞传代到直径10 mm 培养皿，细胞汇合度达到95%以上时准备转染。转染前1小时将培养皿中的细胞培养液换为不含血清的新鲜DMEM。 通过脂质体转染的方法将载体质粒、包膜质粒、包装质粒共转染293T细胞。 3）病毒的收集 转染后48h后第一次收集病毒上清，72h后再收集一次。 4）病毒的浓缩 使用Amicon Ultra-15 centrifugal filter devices