5-牛蛙骨髓染色体标的制备与观察5-牛蛙骨髓染色体标本的制备与观察.docVIP

细胞生物学实验2014-2015（1） 报告成绩 实时记录成绩 实验五 牛蛙骨髓染色体标本的制备与观察 学生姓名 学号 班级 座位号： 同组同学 日期： 年 月 日 备注： 【Introduction】 （1）简述染色体显色技术：将没有染色的中期染色体经过预处理后，再用不同的方法和染料处理，使染色体上出现明暗相间或深浅不同的明显而稳定的斑带。每条染色体都可被准确识别和鉴定，甚至染色体结构异常也可被检出。染色体显色技术分为两大类，一类是产生的染色带分布在整个染色体上，如G、Q和R带；另一类是只能使少数特定的区域显带，如C、T和N带。染色体显色技术极大地促进了细胞遗传学的发展，使每条染色体都可被准确识别和鉴定，甚至出现小的染色体结构异常也可被检出。 （2）制备中期染色体标本的原理和应用：识别染色体的形态特征的最佳时期是细胞有丝分裂中期和早后期。这时染色体收缩程度最大，形态最稳定，并且分散排列、易于计数。如果在同一时间内获得不同物种的染色体标本，就可以了解不同物种之间的染色体水平的异同；或者在同一时间内获得同一物种不同技术处理条件下的染色体标本，还可以了解不同技术处理对染色体的影响。 【Materials methods】 实验仪器：复式双筒显微镜（带油镜）；Motic数码互动系统；擦镜纸/盖玻片；载玻片/镊子；记号笔；小片滤纸；移液器/吸头；香柏油/二甲苯；搪瓷盘，剪刀，烧杯，小离心管，玻璃注射器；离心机，一次性手套，骨剪（实验班公用），冰箱（0℃）。 实验材料：肉用成体牛蛙（两组1只）。 实验试剂：0.65％生理盐水；甲醇—冰醋酸(3:1)固定液；蒸馏水；自来水;Giemsa染液。 实验操作： 1．动物前期处理：牛蛙称重→注射秋水仙素→3.5~4小时后麻醉→取牛蛙→肢解。 2．取骨髓：剪下四肢→剔骨→剪开骨髓腔→生理盐水冲洗→分四个离心管离心→弃去上清液→生理盐水吹打沉淀物→合并于一管。 3．低渗：每管加蒸馏水1 ml→吹打混匀→30度下静置20 min。 4．固定：离心→弃去上清液→加甲醇-冰醋酸固定液l ml→固定15分钟→吹打悬浮→重复上面步骤一次→离心→弃去上清液→吹打悬浮。（一共固定2次） 5．滴片：从冰箱取出载玻片→立即从高处滴20 μl悬液→待干燥。 6．染色：放入Giemsa液中染色20分钟→自来水缸中浸去浮色→待干燥。 7．镜检：首先10倍镜下找到线团状细胞核→转到40倍镜下拍照保存→如果效果不好可转回10倍镜再次寻找→转到40倍镜下拍照保存→找到满意的图像后将图像移至视野正中央，转油镜观察图像，拍照保存。（观察完毕立即清理油镜镜头） 【Results】 如下图所示，在100倍油镜下，可以观察到许多染成深色的细胞核，以及少数的线团状细胞核。所得标本中细胞密度较适中。处于分裂中期相的细胞数量较少，约占10%左右。分裂中期的每条染色体呈现X型，有两条染色单体，四条染色体臂，长度适中，呈蓝紫色，中间由着丝粒相连接。牛蛙的染色体数目2n=26。我观察到的分裂中期的染色体略有重叠，分的不是特别开。 【Discussion】 讨论实验为何出现所得结果。若实验结果不理想，请分析是何原因？如何改进？ 答：（1）染色体分散不好，有重叠：因为是在30度下低渗的，所以温度应该足够，有可能是低渗时间不足；也可能是载玻片取出后放置了一会儿，冰冻不足或有油污；滴片高度有70厘米应该足够，所以还可能是没有吹气使其散开。 （2）染色体边缘发毛，结构不清晰：可能是固定时间不够，或者细胞与固定液没有充分混匀；还可能是低渗过度；或者油镜镜头不干净，所以每次观察完毕应该立即清理油镜。 讨论中期染色体染色在医学遗传学中的实际应用。 答：在同一时间内获得不同个体的染色体标本，就可以了解不同个体之间的染色体水平的异同；或者在同一时间内获得同一物种不同技术处理条件下的染色体标本，就可以了解不同技术处理对染色体的影响。 举例来说，染色体复杂重排是一种罕见的染色体结构异常，通常涉及3个及3个以上的断裂点。某个具有多种先天性异常的新生儿，经诊断为1号和5号染色体的非平衡易位。用高分辨G显带染色体技术对患者父母的染色体进行检查，发现患者的母亲有一个复杂重排，再对父亲做类似检查便可确定该患者的核型 [1]。 【Questions】 1. 取骨髓前，为什么要给牛蛙注射秋水仙素？ 答：秋水仙素的作用是抑制纺锤体的形成，对细胞微管系统有影响，可以使分裂的细胞停止在有丝分裂中期，这样可以得到比较多的有丝分裂中期细胞。有丝分裂中期的细胞染色体已经