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FISH试剂盒说明书 FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。?FISH(fluorescence?in?situ?hybridization)荧光标记的原位杂交技术? 试剂和说明? 提供的材料? 一盒包含4种试剂，可做20次试验，一次检测22mm×22mm靶区。? X/Y?DNA探针盒：? X/Y?DNA探针（已提前变性）：﹣20℃避光保存? DAPIⅡ复染剂：﹣20℃避光保存? NP-40：﹣25~﹣30℃? 22×SSC：﹣20℃~﹣25℃? 储存和处理? 未开封X/Y?DNA试剂盒﹣20℃避光干燥处保存。20×SSC盐和NP-40可以单独储存于室温。阳性对照片应在-20?℃条件下，密封加干燥剂保存。? 需要但公司不提供的材料? 实验室试剂?超纯甲酰胺? 100%乙醇，室温储存?浓缩的（12N）盐酸?1N氢氧化钠? 纯净水（蒸馏水或去离子水或Milli-Q），室温储存?固定剂（3:1?甲醇：乙酸）每日新鲜配置?Drierite(商品名，干燥用无水硫酸)和液氮 实验室设备? 荧光显微镜设备和推荐的滤光片? 相差光学显微镜? 预清洁的显微镜玻片? 载玻片加热器（45℃-50℃）? 22mm×22mm玻璃盖玻片? 可调容积吸管（1-10ul）和无菌微量移液管头? 聚丙烯微量离心管（0.5ml或1.5ml） ?计时器?磁力搅拌器?漩涡混合器?微量离心机?刻度量筒? 水浴锅（67±2℃和73±1℃）?有氧培养箱（42℃）?钻石笔?湿盒?镊子? 一次性注射器（5ml）? 染色缸（6）建议型号：Wheaton?Product.No.900620竖式染色缸? pH剂和pH试纸?温度计? 金属丝试管架?橡胶胶水? 0.45um细孔过滤设备 工作液的准备? 20×SSC? 66g????20×SSC? 200ml??纯化水? 250ml??最终量? 彻底混合，用pH计室温下测pH。如果需要，用浓盐酸调pH到5.3。加纯水至总量250ml。通过0.45um孔径的过滤设备过滤。室温储存6个月。?? 变性液? 49ml???甲酰胺? 7ml????20×SSC??pH?5.3? 14ml???纯化水?70ml???最终量? 充分混合，放置于玻璃染缸。用pH计室温下测pH。确保pH在7.0-8.0。储存于有盖容器2-8℃。可最多使用1周。每次用前测定pH。? 乙醇洗液? 用100%乙醇和纯化水v/v稀释70%，85%。盖紧容器盖子室温下储存。若未发生蒸发或因过量使用所致溶液稀释，可使用1周。? 0.4×SSC洗液? 950ml????纯化水? 20ml?????20×SSC??pH?5.3? 1000ml???最终量? 彻底混合。用pH计室温下测pH，用1N氢氧化钠调pH至7.0-7.5。加纯水至总量1000ml。通过0.45um孔径的过滤设备过滤。未使用过的液体室温储存6个月。使用过的液体当日丢弃。? 0.1%NP-40在2×SSC中? 100ml????20×SSC??pH?5.3? 849ml????纯化水? 1ml??????NP-40? 1000ml???最终量? 彻底混合，用pH计室温下测pH，用1N氢氧化钠调pH至7.0-7.5.加纯水至总量1000ml。通过0.45um孔径的过滤设备过滤。加入70ml至染缸中保持室温。未使用的液体于加盖容器中室温储存6个月。使用过的液体当日丢弃。 标本收集、处理、储存和玻片准备 标本收集和处理? FISH测试步骤? 标本DNA变性：? 1.?在准备玻片前将杂交湿盒（一个密闭容器）置于42℃培养箱预热至42℃。 ?2.?加入变性液至玻片染色缸并于73±1℃水浴至少30min。使用前测量温度。? 3.?标本DNA变性：将准备好的玻片浸泡在73±1℃变性液中5min。每一个玻片染色缸一 次不要放入超过4张玻片。? 4.?用镊子将玻片从变性液中移出并立即置于室温下70%酒精洗液。摇动玻片除去甲酰胺。 让玻片立于酒精洗液中1min。? 5.?从70%酒精中移出玻片，依次用85%、100%酒精重复步骤4。? 6.?晾干多余的酒精：用吸墨纸触及玻片底边并用实验室擦拭纸擦拭玻片下面。?P5? 7.?在滴加探针溶液前，将玻片置于45-50℃载玻片加热器上不超过2min。? 注意：如果在探针准备好之前玻片已备好超过2min，玻片应保留在100%酒精广口瓶内。在将玻片置于玻片加热器前不要风干。? 探针准备? 1.?将探针在室温复温，以降低其粘度便于准确吸取。? 2.?涡流混合。在微量离心机轻微离心1-3s，使内容物沉于试管底部。再次轻轻涡流混合。 ?注意：探针是提前变性的，在标本玻片上滴于靶区。? 杂交? 1.?将10ul探针溶液滴于玻片的靶区。立即将22mm×22mm盖玻片