环境工程微生物实验指导书.doc

PAGE  PAGE  PAGE 28 实验一 光学显微镜的操作及细菌形态观察 1.1 实验目的 掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养。 观察几种典型细菌的形态与构造，学会绘制微生物图。 1.2 实验器材 显微镜、二甲苯、香柏油、载玻片、盖玻片、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、球衣菌、假单胞菌、固氮菌标本片。 1.3 显微镜的结构及其操作方法 1.3.1 普通光学显微镜(Light Microscope) 1.3.1.1 光学显微镜的结构和各部件作用 观察、检验微生物通常用光学生物显微镜（见图1-1），显微镜分机械装置和光学系统两部分。 一 机械装置 (1) 镜筒：镜筒长度一般是160cm。它的上端装目镜，下端装物镜回转板。回转板上一般有三个物镜。 (2) 转换器：位于镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个孔或5个孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。 (3) 载物???：载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光线可以通过。两旁有弹簧夹，用以固定标本或载破片。有的载物台上装有自动推物器。 (4) 调节器：镜筒旁有两个螺旋，大的叫粗调节器，小的叫细调节器，用以升降镜筒，调节物镜与被观察物体之间的距离。 二 光学光学系统 （1）目镜：一般使用的显微镜具有2—3个目镜，其上刻有“5×”、“10×”、“15×”(或“16×”)等数字及符号，意即放大5倍、10倍、15倍(16倍)。这三种透镜的焦距分别为50mm、25nn、16mm，线视场分别为20mm、14mm、10mm。 （2）物镜：物镜装在回转板上，可分为低倍物镜、高倍物镜和油镜三种。相应的放大倍数是10×（5×）、40×（50×）、100×（90×），相应的工作距离是7.63mm、0.5mm、0.198mm，物镜上常标注数值孔径（N.A）。使用低倍镜和高倍镜时，一般做活体观察，不进行染色。在观察原生动物时，低倍镜主要用来观察全部原生动物的种类和观察它的活动状态，而高倍镜则可以看清楚微生物的结构特征。油镜在大多数情况下是用来观察染色的涂片。 （3）集光器 集光器在载物台的下面，用来集合反光镜反射来的光线。集光器可以上下调整，中央装有光圈，可以调整光线的强弱。当光线过强时，应缩小光圈或把集光器向下移动。 （4）反光镜 反光镜装在显微镜的最下方，有平凹面反光镜。 1.3.1.2 光学显微镜的分辨率与放大倍数 显微镜的分辨率是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。光学显微镜的分辨率受光干涉现象的限制。 分辨率（最小可分辨距离）=1/2光波波长/数值孔径 （1-1） D=λ/2n·sin(α/2 ) （1-2） N.A.=nSin(α/2 ) （1-3） 式中 D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 N.A：数值孔径。 λ：可见光的波长（平均0.55mm）。 n：物镜和被检标本间介质的折射率。 a：镜口角（即入射角），该角度决定于物镜的直径和焦距见图（1-2）。 例如：最大入射角为120°，其半角的正弦为sin60=0.87，以空气为介质时，N.A =1×0.87=0.87；以水为介质时，N.A.=1.33×0.87=1.15；以香柏油为介质时，N.A.=1.52×0.87=1.31，见图（1-3）。 肉眼所能感受光波的波长从200mm（紫光）到700nm（红光）。设感受光波的平均长度为550nm（0.55um），N.A.=1.25，则分辨率=1/2×0.55/1.25=0.22um，而细菌大小从0.5～2um，故正好看到细菌。用紫光光源效果更好。 显微镜的总放大倍数等于物镜与目镜放大倍数的乘积。 即：显微镜的放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 观察微生物时，常用放大10倍或15倍的目镜。目镜装在镜筒上端，在使用过程中并不经常变动，通常所谓的低倍镜、高倍镜或油镜的观察，主要是指使用不同物镜而言。例如使用10×目镜和40×物镜（高倍镜）所得物象的放大倍数是400倍。 油镜的放大倍数是最大的（90`或100倍）。放大倍数这样大的镜头，焦距就很短，直径就很小，从标本片透过来的光线，因介质密度不同（从标本片进入空气，再进入油镜），有些光线因折射或全反射，不能进入镜头，致使进入的光线较少，物象显相不清。所以为了不使通过的光线有所损失，须在物镜和标本片中间加入与玻璃折射率（n=1.52）相仿的油（香柏油，n=1.55）。因为这种物镜使用时须加香柏油，所以我们称它为油镜。一般的低倍镜或高倍镜使用时不加油，所以也称干镜。 1.3.1.3 光学显微镜的使用与保管 一 低倍镜的使用方法 （1）置显微镜于固定的桌上，窗外不宜有