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免疫学实验技术;一、免疫细胞分离与功能测定技术 1.免疫细胞分离与纯化 2.免疫细胞功能测定;1.免疫细胞分离与纯化 (B细胞、T细胞、NK细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、DC、红细胞等) 2.免疫细胞功能测定;1）单个核细胞分离 ? ◆葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法 ◆ Percoll不连续密度梯度离心法;1）单个核细胞分离;;◆尼龙棉柱分离;◆E花环分离;◆免疫吸附分离;◆免疫磁珠分离法;◆免疫磁珠分离法;;磁珠分离细胞的重要指标是：??? 纯度和得率：取决于磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠会影响细胞活性。目前市场上有2种磁性细胞分离系统：* Small particles (≈50 nm) － MACS* Large particles (1200~4500 nm) －others（如Dynal）;小磁珠 优点：分离后续培养、 可上流式检测 缺点：强的磁场、 速度慢得率低、 成本昂贵大磁珠? 优点：试管中完成（简单）、易于增减细胞用量、速度快得率高、 成本低； 缺点：影响细胞活性不利于培养、纯度低、容易阻塞FCM的喷嘴?；;◆ flow cytometry;◆ T细胞增生(转化)试验 ◆ T细胞介导的细胞毒试验原理 ◆ T细胞功能的体内检测法 ◆ 流式细胞术 ◆ T分泌细胞因子功能测定;◆ T分泌细胞因子功能测定;◆ T分泌细胞因子功能测定;◆ T分泌细胞因子功能测定;◆ T分泌细胞因子功能测定;◆ B细胞转化试验 ◆ 溶血空斑形成试验 ◆ 反向溶血空斑试验 ◆ 酶联免疫斑点法 ;◆ 酶联免疫斑点法 ;◆ 酶联免疫斑点法 ;◆ 酶联免疫斑点法 ;◆ 酶联免疫斑点法 ;1)形态学检查法 2) 51Cr放射性核素释放法 3)酶释放法： 4)化学发光法 5)流式细胞术;51Cr放射性核素释放法 ;1)中性粒细胞趋化功能测定 2)中性粒细胞吞噬功能测定;3)巨噬细胞吞噬功能测定 4)巨噬细胞胞毒作用;8）DC分离与纯化;8）DC分离与纯化;8）DC分离与纯化;9）红细胞功能测定;9）红细胞功能测定;10）干细胞分离与鉴定;1.细胞膜分子：黏附分子、受体、配体、胞浆蛋白等细胞成分； ◆免疫标记技术 2.可溶性分子：Ig、细胞因子、可溶性黏附分子、可溶性受体、细胞分泌的各种分子等等 ◆免疫标记技术 ◆生物学活性测定（IL-2等） ◆分子生物学测定（mRNA等）;免疫标记技术; 《标记免疫学》创立于60年代初期，开始以放射免疫分析为代表，以后相继派生出许多其它的标记免疫分析方法。 ★60年代末期创立了免疫放射分析，其灵敏度、特异性、线性范围均好。 ★ 70年代初建立.酶标记免疫分析，价格低，检测方便，无放射性污染。 ★ 70年代中期，发光信号进行酶免分析建立，灵敏度高，快速。; ★ 90年代中期发展起全自动的化学发光免疫分析仪。 ★ 80年代初期时间分辨荧光免疫分析问世，已经显示出其良好的发展前景。用时间分辨技术(波长和时间两种分辨)测量荧光，有效地排除非特异荧光，大大地提高了分析的灵敏度，稳定性好，有效期长，测量速度快，易于自动化，因此被公认为有良好发展前景的非放射性标记免疫分析方法之—。 重点：提高灵敏度和特异性两大问题。?;2.标记免疫分析的分类1;2.标记免疫分析的分类1;2.标记免疫分析的分类2;;免疫细胞化学技术;一.免疫荧光细胞化学技术--常用荧光素 ;荧光素;一.免疫荧光组织化学技术--常用方法2;一.免疫荧光组织化学技术--常用方法3;4).双重免疫荧光染色法 可在同一标本上定位、定性检测两种抗原。如A抗原的抗体用罗达明(RB200)标记，呈桔红色，而B抗原的抗体用FITC标记呈黄绿色，镜下两种不同激发光，就可以检测不同的抗原成分。 常用下列染色法： ★一步双染色法： ★二步双染色法：;Cell Ag;二.免疫酶组化技术--常用酶 ;二.免疫酶组化技术--常用酶 ;二.免疫酶组化技术--常用酶 ;酶标记抗体免疫组化—常用方法1;酶标记抗体免疫组化—常用方法2;鼠抗人Ab;非标记抗体免疫酶组化—常用方法1;非标记抗体免疫酶组化—常用方法2;3).APAAP法 靶抗原—抗体(如兔抗人)—二抗即桥联抗体(如羊抗兔)—复合物(如兔 APAAP)—底物显色。;4).双PAP法 ;三.亲合免疫组织化学技术—常用方法;三.亲合免疫组织化学技术—常用方法;四.免疫金银及铁标记免疫组化技术;免疫标记测定技术;1.荧光偏振免疫分析(fluorescence polarization immunoassay，FPIA) 2.均相荧光免疫分析(homogeneous fluores