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MTT法测定细胞相对数和相对活力 一、原理 噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。 二、试剂材料准备与实验仪器 1）对数生长期细胞 2）受试因素（药物） 3）MTT：以PBS配制成5mg /ml，抽滤除菌，保存在4?C 4）DMSO（二甲基亚砜） 5）96孔板 6）酶联免疫检测仪 7）细胞培养箱 三、实验步骤（适用于贴壁细胞） 1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。 2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。 3）加入不同浓度的药物，如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的药物，时间依据实验需要，一般3天。 4）小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。 5）每孔加入180 ul新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。 6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。 7）每孔加入150 ul二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。 8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。 三、结果统计学处理 所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p0.05时为相差显著，p0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。或计算抑制率。 四、注意事项与常见问题 1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。 对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。 2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异。 3）贴壁细胞加MTT前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加入0.5%MTT，量为20ul/孔。 4）如???不使用96孔板，培养基超过100 ml，MTT按照10%的比例加入。 5）MTT一般4度保存两周，注意避光保存，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下。 6）对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值；而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm，并且建议以655nm作为参考波长。 7）96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。 8）注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。 9）没有去掉上清直接加DMSO，沉淀会很难溶解。加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，也可在倒之前先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟，然后吸掉上清。加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。 10）为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种细胞，而不作为指标检测孔。 11）除置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解外，可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。 12）关于如何计算IC50 方法有多种 (1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) (2)Bliss法:自己查阅书籍 (3) IC50计算软件，见下面附件（暂时找不到了） (4)自己用EXCEL做趋势线来求IC50，关于LD50的方法与此相似！ (5)在线求IC50或EC50： HYPERLINK http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm \t _blank http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm 13）计算抑制率，公式[（对照-本底）-（给药-本底）]/（对照-本底）*100%.