PCR-SSCP实验操作详细步骤.docVIP

PCR-SSCP实验步骤 一．样品制备 1．PCR扩增并检测。根据不同的引物挑选适合的退火温度进行PCR扩增。扩增产物用2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量3-5ul。PCR产物为10ng/nl左右为最佳。 2．PCR产物与变性buffer混合。在干净的PCR管底部加入5ul SSCP上样缓冲液（变性缓冲液，同《分子克隆》中的测序缓冲液），然后在缓冲液中央加入PCR扩增产物。按照经验，扩增效果在琼脂糖胶上能看出比较亮的带的样品加1ul，效果很好加0.5ul，如果不太好就适当增加1.5、2或3不等，同时加大上样缓冲液的量，比如加3ul的PCR产物，缓冲液加到8ul变性效果更好。 3．PCR产物变性。加好的样品进行离心，使样品集中在管底。PCR仪上95℃变性10分钟，立即取出PCR产物连同架子一同置于冰上静置5min，以免变性的产物复性。 注：3和4步可以在制SSCP胶第四步后，等胶凝的过程中进行。 制胶 装板。在所要进行实验的每一副玻璃板先用自来水冲洗，然后使用ddH2O冲洗，然后使用吸水纸将玻璃板擦拭干，然后再玻璃板上涂抹无水酒精，待2-3min酒精挥发。将玻璃板组装好放入凝胶架子中，两边及底部固定好，两玻璃板保持水平，然后将发条拧紧。（可用无水乙醇测试是否漏胶）。 配胶。 甘油浓度50%的几种浓度大板胶（10ml下层胶，5ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.0mm）： 8% 6%30%PAGE2.7ml1ml10×TBE1ml0.5ml50%甘油1ml0.5mlddH2O5ml3mlAPS70ul70ulTEMED12ul8ulTotal10ml5ml甘油浓度50%的几种浓度小板胶（15ml下层胶，10ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.5mm） 8%6%30%PAGE（4℃）4.05ml2 ml10×TBE1.5ml1m50%甘油1.5m1mddH2O7.5ml6mlAPS105ul70 ulTEMED12ul12ulTotal15ml10ml 3．灌胶。配好胶后搅匀，灌入装好的玻璃板中，注意不能产生气泡，如果产生气泡把板立起，轻轻敲打可使气泡升出胶面，胶面与凹板上沿大约差0.5cm时插上梳子，要保证梳子齿和液面接触处没有气泡，一旦产生要拔出重插。 4．静置。???好的胶平放或与水平成一比较小的角度（10o以下）静置水平桌面上30min左右使之充分聚合。 注：此时可以进行PCR样品变性，即第一部分的3、4步。 上样 1.安板。PAGE聚合好后要及时拔出梳子（时间耽搁长后会使梳子很难拔出），拔梳子时要用力均匀以保持胶孔的整齐。用夹子把胶板固定在电泳槽上，凹槽的一面朝里，安板时首先使板的底边一端先接触电泳液，再缓慢地过度到另一端，以免产生大气泡（产生大气泡会使电泳条带弯曲）。 2．预电泳。从底槽把一些电泳液1×TBE吸到上槽，使液面高出玻璃板矮边1cm以上，并确保上槽不漏液。打开电源，大槽电压调到140-150V，小槽110-120V，预电泳10min左右。(0.1W/cm,10℃，1-3h) 3．点样。用微量进样器把准备好的样品按顺序加到胶孔中。由于边缘效应带型不整齐，每块板中最边上的两个孔最好不要点样。 4．电泳。大槽电压140-150V，小槽110-120V，温度在10-15℃，恒温电泳10个小时以上。 染色 1．固定。把胶卸下，做好起始记号，放入70%乙醇中在摇床上固定15min。固定好后乙醇回收（可以重复使用5次左右），蒸馏水洗两遍，每遍3min左右。若同时染两块胶固定和洗脱都要适当增加时间。 2．染色。染色液（200ml染色液含3.6%的NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml、氨水2ml）染色30min，同时染两块胶要适当增加时间，需40min左右。倒掉染色液，洗3遍，每遍3min，同时染两块胶要适当增加时间。 3．显色。显色液（200ml显色液包含1%柠檬酸钠1ml，甲醛100ul）至清晰。倒掉显色液，加蒸馏洗脱3次停显。 (也可将凝胶浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色10min，在紫外灯下观察) 　 附录 1. 甘油浓度50%的几种浓度大板胶（10ml下层胶，5ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.0mm）： 8% 6%30%PAGE2.7ml1ml10×TBE1ml0.5ml50%甘油1ml0.5mlddH2O5ml3mlAPS70ul70ulTEMED12ul8ulTotal10ml5ml2. 甘油浓度50%的几种浓度小板胶（15ml下层胶，10ml