PCR产物的TA克隆-DNA的胶回收和连接.docxVIP

PAGE7 / NUMPAGES7 PCR产物的TA克隆 (DNA的胶回收和连接) 【实验原理】 1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。 2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。 商品化的T载体有很多。本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。 【试剂与器材】 （一） 试剂 1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。 2.TAE电泳缓冲液 3.琼脂糖（Agarose） 4.6×电泳加样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 5.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。 6.70%乙醇 7.胶回收试剂盒（Omega公司） （二）器材 水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 凝胶成像系统或其它照相设备。 【操作方法】 （一）胶回收试剂盒回收PCR产物（以Omega公司 Gel Extraction Kit为例） 1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。 2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。近似地确定其体积（假设其密度为1g/ml）。加入等体积的Binding Buffer（XP2），于55-65℃水浴中温浴7min或至凝胶完全融化，每2-3 min振荡混合物。（在凝胶完全溶解之后，注意凝胶-Binding buffer混和物的pH值。如果其pH值大于8的话，DNA的产量将大大减少。如果是橙色或红色，则要加入5μl 浓度为5 M，pH为5.2的醋酸钠，以调低其pH值。该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。） 3.取一个干净的HiBind DNA Mini柱子装在一个干凈的2ml收集管内（已备好）。 4.将第三步获得的DNA/熔胶液全部转移至柱子中。室温下10,000 x g离心1分钟。弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。 5.如果DNA/凝胶熔液的体积超过700ul，一次只能转移700ul至柱子中，余下的可继续重复第5步至所有的溶液都经过柱子。每一个Hibind DNA回收纯化柱都有一个极限为25μg DNA的吸附能力。如果预期产量较大，则把样品分别加到合适数目的柱子中。 6.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。转移300μl Binding Buffer（XP2）至柱子中，室温下， 10,000 x g下离心1min。 7.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。转移700μl SPW Wash buffer（已用无水乙醇稀释的）至柱子中。室温下10,000xg离心1min。（浓缩的SPW Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释。如果DNA洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下）。 8.重复用700μl SPW Wash buffer洗涤柱子。室温下10,000xg离心1min。 9.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。室温下,13,000 x g离心2 min以甩干柱子基质残余的液体。 10.把柱子装在一个干凈的1.5ml离心管上，加入15~30μl（具体取决于预期的终产物浓度）的Elution Buffer(或TE缓冲液)到柱基质上，室温放置1min, 13,000xg离心1min以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出70-80%的结合DNA。 如果再洗脱一次的话，可以把残余的DNA洗脱出来，不过那样的浓度就会较低。 （二）连接反应（以Takara公司pMDTM18-T Simple Vector Kit为例） 1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 μl。 ???? pMDTM18-T Simple Vector????????? 1 μl????? Insert DNA?????????????????????????????????????