培训课件：大肠菌群的测定GB4789.3-2010选编.pptVIP

GB4789．3-2010; 一、? 目的;二、原理;这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化鉴定试验，可将大肠菌群细分为大肠埃希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。 另一种说法：（主要由肠杆菌科中埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属的一部分及沙门氏属的Ⅲ亚属细菌组成。） ;2、测定的意义;3大肠杆菌的生物学特性;在普通营养琼脂上有3中菌落形态： 1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝； 3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。 ;三?、?材料;3、?仪器设备;?4、 培养基和试剂;?四、 检验方法;第一法 大肠菌群MPN计数法;（2） 液体样品 以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。 （3） 样品匀液的pH 值应在6.5-7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。;（4） 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。;?（5）、 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。;? 2、 初发酵试验;记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。 ;3、 复发酵试验;煌绿乳糖胆盐( BGLB）肉汤管;4、 大肠菌群最可能数（MPN ）的报告;结果报告： MPN 表;第二法大肠菌群计数法;大肠菌群在去氧胆酸钠琼脂上的典型特征;大肠菌群在结晶紫中性红琼脂(VRBA)上典型特征 ;大肠杆菌在MFC琼脂上的典型特征 ;1、 样品的稀释;2、 平板计数;? （3） 平板菌落数的选择 选取菌落数在15-150 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。;结晶紫中性胆盐琼脂;? （4）、 证实试验 从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36℃±1℃ 培养24h-48h ，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。;2、 平板计数;例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取 其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105 CFU/g（mL）。 ;可疑菌落特点： 具有金属光泽的深紫黑色菌落； 不带或略带金属光泽的菌落； 中心色较深的淡紫黑色菌落。;三、注意事项; 2、胆盐可抑制革兰氏阳性菌的生长，有利于大肠杆菌的生长繁殖。; 3、接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。; 4、大肠菌群菌落在EMB琼脂上大多呈紫黑色有金属光泽或无金属光泽。应取典型菌落，如无应多取几个菌落，以免出现假阳性。 一般平板上有较多的大肠杆菌典型菌落，且革兰氏染色为阴性，可做出判定。; 5、对初发酵时未产气的发酵管有疑问时，可用手轻轻敲动??摇动试管，如有气泡沿管壁上升，应考虑有气体产生，做进一步试验。; 6、 MPN检索表是采用三个稀释度九管法，较理想的结果是最低3管为阳性，最高3管为阴性。如无法估测样品中的菌数时，应做一定范围的稀释度。; 7、 MPN检索表只提供了3个稀释度，若改用其它浓度时，表内数字应相应增加或减少。 ; 谢谢!