无菌检查法及微生物限检查法2010年版.doc

附录Ⅻ B 无菌检查法 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料、及其他 品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检 验条件下未发现微生物污染。 无菌检查应在环境洁净度 10 000 级下的局部洁净度 100 级的单向流空气区域 内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。 培养基 培养基的制备及培养条件 培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在 2 ℃～ 25 ℃、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1年内使用。 1. 硫乙醇酸盐流体培养基 酪胨 (胰酶水解) 15.0g 氯化钠 2.5g 葡萄糖 5.0g 新配制的 0.1% 刃天 L-胱氨酸 0.5g 青溶液 1.0 ml 硫乙醇酸钠 0.5g 琼脂 0.75g (或硫乙醇酸) （ 0.3 ml) 水 1000 ml 酵母浸出粉 5.0g 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 为弱碱性，煮 沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节 pH 值使灭菌后为 7.1 ± 0.2 。 分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉 红色）不超过培养基深度的 1/2 。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不 得超过培养基深度的 1/5 ，否则，须经 100 ℃水浴加热至粉红色消失（不超过 20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。 硫乙醇酸盐流体培养基置 30 ℃～ 35 ℃培养。 2.改良马丁培养基 胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g 酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁 0.5g 葡萄糖 20.0g 水 1000 ml 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 值约为 6.8 ，煮沸，加入葡 萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节 pH 值使灭菌后为 6.4 ± 0.2 ，分装，灭菌。 改良马丁培养基置 23 ℃～ 28 ℃培养。 3.选择性培养基 按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或 使用前加入适量中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法验证试验。 4.营养肉汤培养基 胨 10.0g 氯化钠 5.0g 牛肉浸出粉 3.0g 水 1000 ml 取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 为弱碱性，煮沸，滤清，调节 pH 值使灭菌后为 7.2 ± 0.2 ，分装，灭菌。 5.营养琼脂培养基 按上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入 14.0g 琼脂，调节 pH 值使灭菌后为 7.2 ± 0.2 ，分装，灭菌。 6.改良马丁琼脂培养基 按改良马丁培养基的处方及制法，加入 14.0g 琼脂，调节 pH 值使灭菌后为 6.4 ± 0.2 ，分装，灭菌。 培养基的适用性检查 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。 无菌性检查 每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），培养 14 天，应无菌生长。 灵敏度检查 菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第 0 代），并采用适宜的菌种保存技术，以保证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B)