[生物]RNA干扰文库及其在功能基因组学研究中的应用的论文.docVIP

　　[生物]RNA干扰文库及其在功能基因组学研究中的应用的论文 人类基因组大规模测序已经基本完成。但破解基因组的序列只是一个起点，目前多数基因的功能还不清楚，因此基因功能的研究是今后的发展趋势。传统研究基因功能的最有效技术之一是细胞和小鼠的基因敲除技术。但该技术存在技术复杂、周期长、费用昂贵等缺点，极大地限制了它的应用。应用物理和化学突变技术可以诱导基因的随机突变，导致细胞或动物表型的缺陷，直接进行基因功能的筛选。但由于该方法通常需要两个等位基因同时突变才会出现明显的表型，成功的机会比较低。而rna干扰(rnainterference，rnai)文库有希望成为一种简单、高效、大规模、高通量的功能基因组学研究的工具。 　　1rnai及rnai文库 　　rnai是近年来的重大发现，是动物和植物界普遍存在的一种防御反应。rnai被细胞内出现的双链rna(dsrna)所激??，可以高度特异地抑制同源基因的表达。根据目前的研究，rnai的可能机制如下：长片段dsrna在细胞内被ⅲ型rna酶dicer切成长度大约为19～23nt的小片段干扰rna(smallinterferingrna，sirna)，由sirna参与构成复合物risc(rna-inducedsilenceplex)。sirna通过与同源mrna的特异配对，引导risc特异地降解同源mrna，导致基因表达的抑制。.因此小片段的sirna也可以诱导高效的基因沉默。 　　在线虫，注射或喂食dsrna能引起特异基因在动物各器官的沉默，而且该抑制作用可以持续到第一代的子代动物。但是在哺乳动物细胞，通过长片段dsrna直接转染会引起细胞的毒性反应，基因沉默效果差。近年来，陆续有用体外合成的sirna，或用质粒、病毒等载体在细胞内表达sirna达到在细胞和小鼠抑制特定基因表达的报道。 　　rnai文库(rnailibrary)是人工构建的能通过诱导rnai抑制众多不同基因表达的混合文库，可以用于建立功能缺陷(lossoffunction)的生物或细胞库，进行表型的筛选。该技术在线虫的应用最为成功。在线虫等模式生物的研究中，应用rnai文库建立随机基因抑制的线虫，再进行表型的筛选，已在其胚胎发育等领域取得了重要的发现。该文库用含方向相对的两个t7启动子的载体，可从一个随机克隆的cdna模板分别转录出长片段的正义和反义rna，形成dsrna，在体内被dicer切割成小片段的sirna，特异地抑制靶基因的表达。由于细胞外dsrna不能在哺乳动物细胞有效地诱导rnai，另外，长链dsrna(gt;30nt)可导致哺乳动物细胞的毒性反应，出现非特异的细胞生长停滞和凋亡，上述转录长片段dsrna建立rnai文库的方法不能应用于哺乳动物及其细胞。 　　线虫等模式生物与人的差距较大，从模式生物获得的研究结果虽然有比较重要的意义，但不能取代在人和其他高等动物的直接研究。因此建立可以用于人的细胞以及其他哺乳动物细胞的rnai文库有非常重要的意义。rnai文库将为研究基因功能、发现新的药物靶基因、发现疾病相关基因、探索肿瘤治疗新途径等提供重要的方法。到目前为止，已经报道的在哺乳动物细胞建立rnai文库的方案有两类。我们将对这两类建库方案及其在功能基因组学研究中的应用作一介绍。 　　2哺乳动物细胞已知基因rnai文库 　　哺乳动物细胞已知基因rnai文库构建的方法如下：首先选定靶基因，根据靶基因的dna序列和sirna设计原则，合成sirna，或合成寡核苷酸序列并克隆到表达载体，或用pcr的方法扩增为sirna表达盒。众多针对不同基因的sirna或sirna表达载体或表达盒即构成有限的rnai文库。应用该文库转染哺乳动物细胞可以特异地抑制不同基因的表达，通过表型的筛选来发现功能基因，如信号转导通路新分子的筛选、与肿瘤细胞存活或转移相关基因的筛选等。 　　aza-blanc等应用dharmacon公司生产的针对510个基因(包括了大多数激酶基因)的sirna文库，通过转染hela细胞筛选了对trail诱导细胞凋亡有调控作用的基因。trail是tnf家族的一员，具有抗肿瘤的功能。实验证明，trail蛋白能同dr4和dr5受体结合，诱导多种肿瘤细胞的凋亡，而对正常细胞没有影响。aza-blanc等的筛选既发现了一些能增强trail诱导细胞凋亡的基因，也发现了一些具有抑制作用的基因。这些基因包括以前已知对trail功能有调控作用的基因如gsk30α和srp72，也包括一些未知的调控基因如dobi、mirsa等，对了解trail的作用机制和抗肿瘤药物的开发有重要的意义。 　　berns等构建了针对7914个基因的人rnai文库。他们应用了shrna(shorthairpinrna)反转录病毒载体，每一