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实验一二三四—DNA重组技术
质粒提取; 碱裂解法小量制备质粒DNA;一.实验目的及背景;质粒的应用;本实验目的;分离质粒DNA方法; 1. 溶菌酶
2. 碱裂解: SDS, NaOH
pH 12.0-12.5
3. 中和: pH 4.8 醋酸钠
;碱变性法基本原理;实验方法; ;注意事项;DNA的酶切;一.实验目的及背景;限制酶;Ⅱ型酶;酶切反应注意事项:;2.DNA:;3.反应缓冲液:;4.酶解温度与时间:; 质粒 5-8μl
10? buffer 1.5 μl
15μl体系中 E1 0.25 μl
E2 0.25 μl
ddH2O: 5-8 μl; ;琼脂糖凝胶电泳;琼脂糖凝胶电泳;琼脂糖凝胶电泳;注意事项
合适的凝胶浓度
正确的电泳方向;胶回收;核酸的体外连接;1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关,连接平齐末端,必须加大酶量,一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。 2、在连接带有粘性末端的DNA片段时,DNA浓度一般为2-10mg/ml,在连接平齐末端时,需加入DNA浓度至100-200mg/ml。 3、连接反应后,反应液在0℃储存数天,-80℃储存2个月,但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。 4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定,所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37℃,在连接粘性末端时,反应温度以10-16℃为好,平齐末端则以15-20℃为好。 5、在连接反应中,如不对载体分子进行去5‘磷酸基处理,使用过量的外源DNA片段(2-5倍),这将有助于减少载体的自身环化,增加外源DNA和载体连接的机会。 ; 大肠杆菌感受态细胞 的制备和转化 ;一.实验目的及背景;;实验原理;;;材料、试剂及器具
1、? 材料
E.coli DH5α
转化产物
2、? 试剂
(1)0.1mol/L CaCl 2(灭菌)。
(2)LB液体培养基、固体培养基。
(3)氨苄青霉素(Amp):用无菌水配制成100mg/mL溶液,置 -20℃冰箱保存。;;?;4000rpm,离心10min回收细胞↓用冰冷的0.1mol/L CaCl 2 1mL,悬浮沉淀↓立即放在冰上保温30min↓4℃,4000rpm,离心10min,回收细胞↓用冰冷的0.1mol/L CaCl 2 0.1mL悬浮细胞(务必放冰上)↓分装细胞,每100μl一份。此细胞为感受态细胞;质粒/连接产物的转化
在100μl新鲜配制的感受态细胞中加入连接产物,↓
冰上放置30min
↓
将管放到42℃循环水浴热冲击90s
↓
取出,迅速冰浴2min
↓
每管加400μl LB液体培养基,37℃慢摇复苏40min; ↓
3000rpm,离心5min回收细胞 ↓
吸弃450 μl 上清后,轻轻重悬细胞,全部铺平板,待菌液干燥后倒置培养皿,于37℃培养过夜
↓
次日观察,并记录转化情况,计算转化率(转化子数/μgDNA)。;
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