2014酶工程第五章酶的分子修饰学案.ppt

酶工程 第五章 酶的分子修饰 Contents of chapter 5 第一节 为什么要进行分子修饰什么是酶分子修饰？ 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。 为什么要进行酶修饰 限制酶大规模应用的原因： 1)细胞外稳定性差； 2)酶活性不够高； 3)具有抗原性。 1）提高酶的生物活性（酶活力） 一级结构修饰后发生改变很多情况下会引起高级结构发生改变,从而改变蛋白功能(包括酶活力) 热稳定性 可与酶内部基团形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。 对抑制剂稳定性 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。 对水解酶的稳定性 A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。 第二节 酶分子的修饰方法 金属离子置换修饰 大分子结合修饰(共价/非共价;多结合水不溶分子) 侧链基团修饰(多结合水溶解性小分子) 肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰 酶分子的物理修饰 一 酶的金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。 α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+) 若从酶分子中除去其所含的金属离子，若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。 金属离子置换修饰的过程 a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。 b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。 c. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。 金属离子置换修饰作用 阐明金属离子在催化中的机理 直接做催化反应部位得失电子 屏蔽电荷，使酶活性中心和底物更容易接近 传递电子 提高酶的催化效率 提高酶的稳定性 改变酶催化的动力学特性 主要改变整体构象，调节结合底物口袋大小 二 酶的大分子修饰 聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。 新型修饰剂 2修饰剂的活化 （1）三氯化嗪 （2）琥珀酸酐及N-羟基琥珀酰亚胺 （3）羰基二咪唑法 （4）溴化氰法 3 修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。 (结合效果；酶活性） 4 分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。 大分子结合修饰的作用 催化效率 空间构象 稳定性 抗原性 三 酶分子的侧链基团修饰 采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。 酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。 侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。(一级结构是基础) 催化活性/非催化活性基团的修饰 对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。 (改变对底物亲和能力) 对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代。(改变催化性质) 经常被修饰的残基是： 亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 亲电的Tyr、Trp （1） 常见基团的化学修饰反应：氨基 （2） 常见基团的化学修饰反应：羧基 （3） 常见基团的化学修饰反应：巯基 （4） 常见基团的化学修饰反应：胍基 （5） 常见基团的化学修饰反应：酚羟基 （6）常见基团的化学修饰反应：咪唑基