高产谷胱甘肽酵母菌株的选育和培养条件的初探4页.doc

高产谷胱甘肽酵母菌株的选育和培养条件的初探 摘 要：以Saccharomyces cerevisiaeG796-2 为出发菌株, 通过紫外线照射结合乙硫氨酸平板筛选，连续两代诱变筛选分离得到高产突变株Saccharomyces cerevisiae SE-2； 摇瓶试验胞内谷胱甘肽含量达到2.2%，较出发菌株G796-2提高62.9%，传代试验表明其遗传性能稳定。对SE-2 的培养条件进行了研究。采用正交化实验和双碳源实验对培养基进行优化，结果表明，最佳初糖浓度6%，葡萄糖/糖蜜=3.5:1，半胱氨酸的添加浓度5mmoL?L?1 较为适宜。在优化的培养条件下培养39h，SE-2 谷胱甘肽总量达180mg?L?1 以上, 较G796-2 提高81.2%。 1 前 言 谷胱甘肽，γ-L-谷氨酰-L-半谷氨酰-甘氨酸(γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine，简称GSH)是一种广泛存在于动植物和微生物细胞中具有多种生理功能的三肽[1]。发酵法生产GSH 就是选育(或构建)GSH合成能力强和胞内含量高的微生物、筛选和优化培养基配方、建立和优化发???控制策略、改进和提高下游过程技术等, 最终提高GSH 的产率和质量[2] 。Sakato 等[3] 采用先进的YEWPACKINSTRMENTATION SYSTEM 控制系统发酵合成GSH。林建平等[4]利用啤酒废酵母合成GSH。采用发酵法生产GSH 的关键，是获得性能优良的高产菌株。本课题组选用产GSH 酵母菌株，经过两代紫外线诱变，乙硫氨酸耐性平板筛选，得到GSH 含量更高的突变株，并对该突变株的培养条件进行研究。 2 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 菌种 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)8 株，本实验室保存菌株。 2.1.2 培养基： 1) 斜面与平板培养基(g?L?1)：麦芽汁10；酵母粉3；蛋白胨5；葡萄糖10；琼脂 20。 2) 摇瓶筛选培养基(g?L?1)：葡萄糖30；酵母粉6；(NH4)2HPO4 3；K2HPO4 1；KH2PO41；MgSO40.8；CYS 0.2；ATP 0.2。 3) 摇瓶发酵培养基(g?L?1)：葡萄糖60；酵母粉12；(NH4)2HPO4 6；MgSO4 4.8；K2HPO4 1；KH2PO4 1；FeSO4 0.008；MnSO4 0.008；ZnSO4 0.008；玉米浆 24；糖蜜17；麦汁30。 2.2 实验方法 2.2.1 培养和分析方法 从活化斜面上挑取一环菌体接入摇瓶筛选培养基, 装量为50mL/250mL 三角瓶, 置摇床170r?min?1，30℃培养39h。而发酵培养则是将24h 种子液以10%的接种量，接入发酵培养基，装量50mL/250mL 三角瓶，置摇床170 r?min?1，30℃培养24h。GSH 含量测定方法：四氧嘧啶法[5]。2.2.2 诱变和筛选方法 从活化斜面上挑取一环菌体接入液体培养基，置摇床170 r?min?1，30℃培养16h，4000 r?min?1 离心收集菌体，以0.85%生理盐水洗涤，稀释制得107 个细胞mL?1 菌悬液。取5mL 菌悬液置于直径9cm无菌平皿中, 用紫外灯(功率15W, 距离30cm)照射180s, 将照射后菌液用0.85%生理盐水稀释104 倍,吸取0.2mL 涂布含0.3%氯化锂，100μg?mL?1 乙硫氨酸筛选平板。30℃培养4~6 天，挑选菌落进行筛选。第二代诱变就是将第一代诱变筛选出的高产菌株作为出发菌株，如上述条件培养，诱变，稀释，吸取0.2mL 涂布含0.3%氯化锂，300μg?mL?1 乙硫氨酸筛选平板。30℃培养4~6 天，挑选菌落进行筛选。 从筛选平板上挑取一定数量的抗性突变株至斜面培养基，培养2~3 天后将菌株接入摇瓶筛选培养基，培养39h 后测定GSH 含量。挑取GSH 含量提高的高产菌株进行复筛。复筛就是将初筛的较好的菌种，按每株3 瓶，培养39 小时后测GSH 胞内含量，确定高产菌株。 3 结果与讨论 3.1 菌种诱变筛选 将待筛选的8 株酵母菌接入摇瓶培养基培养，其中G796-2 的胞内含量最高，为1.35%，产量达 39mg?L?1，作为诱变的出发菌株。对G796-2 菌株进行紫外诱变后，涂布筛选平板，初筛得到高产突变株共17 株，然后对这17 株进行复筛，测定GSH 含量，结果见表1。 从表1 看出，BU-14 突变株GSH 含量达到1.8%，可以作为进一步诱变的出发菌株。对BU-14 进 行第二代诱变，涂布筛选平板，初筛得到高产突变株共8 株，然后对这8 株进行复筛，测定GSH 含量，结果见表2。从表2 看出，SE-2 含量达2.2%。同时对SE-2 突变株和其它产GSH