鸭血SOD工艺优化夏骏.doc

鸭血提取SOD工艺优化 ，， 1 浙江大学 竺可桢学院 理科平台，浙江 杭州，310058；2.浙江大学 高分子科学与工程学系，浙江 杭州，310058；3.浙江大学 竺可桢学院 巴德年医学班 摘要：本文基于已有的鸭血SOD提取工艺，对原有工艺进行优化。通过五因素四水平正交法探究热变性实验条件，得到热变性最佳温度为60摄氏度，最佳PH=7.0，热变性时间15min，同时探索了不同Cu-Zn离子配比对热变性的影响。通过新工艺提取的鸭血SOD比活达到2150U/mg，优化后的提取工艺对于SOD的提取更加有效，为禽血SOD提取的工业化提供了实验指导，同时为大规模生产SOD提供了必要的实验支持。 关键词：鸭血SOD 提取工艺 优化 正交法 热变性条件 Cu-Zn离子 超氧化物歧化酶(简称SOD)是生物体内防御氧化损伤的一种十分重要的抗氧化酶之一, 作用于超氧阴离子发生歧化反应, 清除体内的超氧阴离子自由基, 对细胞膜起到保护作用。之前国内外都对SOD 进行了比较全面的研究, 在SOD的化学性质、生物学特性、分子结构及药理等领域都有了详细的研究成果, 且已从植物、动物、微生物等多种生物材料中分离纯化到SOD。有人采用基因工程的手段成功提取了SOD，根据基因工程的特点制备的SOD虽然具有较少的免疫及过敏反应，但是因其生产周期较长因此并不适合大规模的应用。与此同时，从植物中提取SOD工艺复杂且不易纯化。由于SOD被广泛应用于化妆品业和食品工业。工业上的大量需求，使得对SOD的分离提纯工艺研究成为必要，而如何能够以最低成本及最高活力提取SOD正是目前科学界对于SOD的研究热点。 我国血液资源丰富，但是对禽血如鸭血的利用相对较少，如何能够解决集中屠宰产生的血液造成的污染以及建立一条成熟的禽血加工生产线成为一个重要的课题。基于这点，作者在如何优化鸭血SOD提取工艺上进行了相关条件的研究。 1材料与方法 1.1材料 购于农贸市场幼龄鸭两只成年鸭1只，从颈部剪喉取血约250ml，用事先配制好的萃取剂（具抗凝成分）处理。 试剂： Tris进口分装； 柠檬酸； 柠檬酸三钠；焦没石子酸；KH2PO4·3H20 ； Folin B及其他无机试剂 均为国产AR 仪器： 紫外分光光度计,SSW微电脑电热恒温水浴锅；Ultraspec 2100 Pro UV/visual Spectrophometer；Mettler Toledo PL2002 分析天平；DEAE-Sepharose-FF层析柱及调料；透析袋；Nanodrop 1000；Eppendorf centrifuge 5418；Eppendorf centri 5417R； Amersham pharmaciaiotech amersham biosciences RECIII 1.2 SOD酶活力测定方法 参见国标邻苯三酚自氧化法（GBT 5009.171-2003） 1.3 蛋白含量的测定 采用Folin酚法测定样液中蛋白质的含量，具体方法见[4] 1.4总体工艺流程 1.4.1 萃取工艺 按照王仲礼的方法配制萃取剂，萃取剂的量为血量的1/3,由于该萃取剂中含有抗凝血成分，因此无需再加入抗凝剂。再加入约和血液等量的6.5%的NaCl溶液，迅速剧烈振荡，磁力搅拌1h左右，此步非常关键。 1.4.2 热变性最优条件探究 SOD是一种热稳定性相对较好的蛋白质。禽血中主要含有的是Cu-Zn SOD，因此添加Cu,Zn离子可能在其热变性的过程中具有一定的保护作用。本实验根据前人对猪血、牛血等SOD热变性实验条件的研究，使用了由学韬软件工作室开发的正交设计助手设计了由加热温度，加热时间，溶液PH，三个参数和四个水平组成的正交法。温度设置为50~80℃，间隔为10℃；加热时间为（5、10、15、20min），pH为（5、6、7、8）刘晓红，孟静波等报道，在Cu-Zn SOD在热变性的过程中加入Cu2+或同时加入Cu2+，Zn2+离子对保持相对较高的SOD活力及加快血红蛋白的变性速率有较显著的效果。因此在使用通过正交法获得的最佳条件的情况下，设置空白试验，分别加入Cu2+，Zn2+以及同时加入两种离子分析其热变性后的酶液比活力，两种离子的浓度设定为 1.4.3 SOD的提纯 1.4.3.1SOD初步提纯 SOD经过热变性后进行抽滤，并离心弃沉淀，加入95%乙醇和氯仿后取上清再加入静置一段时间后离心弃沉淀，再加入一定量的丙酮所得沉淀即为Cu-Zn SOD。具体过程见图1 图1 鸭血SOD初步提纯流程图 1.4.3.2 SOD透析 获得的SOD用2.5mmol/l的PBS缓冲液进行配置，配置方法见[9] 4°C条件下选用