第3章转基因生物和基因打靶.ppt

*;转基因生物;第一节 转基因动物;转基因动物：以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。;▲1989年，意大利学者用精子作为载体转移目的基因，成功地获得了纯系转基因小鼠。 ;▲1999年2月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔”诞生，其体内被检测到带有人的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年“中国十大科技进展”之一。;转基因超级鼠;超级奶牛体积比普通奶牛的大三倍 （英国）;上海转基因动物 ;东北农业大学－国内首例绿色荧光蛋白“转基因” 克隆猪;转绿色荧光蛋白的克隆兔;二、基本原理;转基因技术操作的具体流程;（二）重组载体的构建 选择合适的基因载体，要求载体序列不干扰外源基 因的表达、能接受外源DNA容量大小、稳定、对宿 主细胞无威胁。 （三）重组载体的体外验证（in vitro） 重组载体的正确性验证，如拷贝数、连接方向等。 对于连有组织特异性启动子或局部体细胞转染的载体 需先在同类型的体外离体培养细胞中初步验证表达特 性。;（四）基因转移 1）化学法 2）物理法 3）生物法 （五）转基因动物模型的验证 从基因组、mRNA、蛋白质和整体表型各个层次进行 验证。用核酸杂交、聚合酶链反应、免疫印迹杂交、 酶联免疫法、免疫荧光法和Western杂交法等多种方 法，筛选出有外源基因整合的阳性动物，传代后检测 外源基因在转基因动物中的表达情况，对外源基因表 达产物的生物活性和生化性质进行鉴定，以及检查转 基因动物的生理功能和是否出现某些疾病病症状的表 型等。;（六）组建转基因系 第一代转基因动物是半合子转基因动物，因为外源基因仅在一条染色体上稳定整合。只有通过选种选配，将两个半合子转基因动物成功交配，才能得到纯合子转基因动物，建立转基因动物家系，外源DNA才能在后代中稳定遗传。 ;1、显微注射法：以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的外源DNA直接注射到受精卵的原核内，再把接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管，使之发育成正常的幼仔，获得转基因动物个体。 目前应用较广泛，最早最经典的方法。 操作技术性很强，受过严格训练的专业人员操作，发育成转基因动物的受精卵也只占注射卵的5％。因此用增大微注射受精卵的数目的办法提高成功率。; 优点： 外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过程直观； 整合率相对高 缺点： 设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求　 低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性 转基因沉默;注意事项 1. 显微注射法将外源基因导入生殖细胞和体系胞后，在染色体上的整合位置是随机的 2. 外源基因甲基化程度在胚胎发育过程中会影响其活性 3. 某些外源基因的表达程度可受到个体细胞正常调节机制的控制 4. 由于受到宿主组织分化的影响，外源基因还具有一定的组织特异性;2、胚胎干细胞（ES细胞）法; ; 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的), 获得转基因动物的方法。 　目前这种方法主要应用于鸡胚胎操作。　; ;4、体细胞核移植方法;1997年2月17日英国Roslin研究所的Wilmut从1只六岁母羊的乳腺上皮细胞成功的克隆到了一只绵羊一多利(Dolly)。这是人类第一次采用分化的体细胞作为供体细胞，它的成功是20世纪生物学重大突破之一。 学术意义在于证明分化的体细胞甚至是分化终端的体细胞核仍有全能性。; ; ;转基因动物研究出现的问题; 转基因动物的应用前景 1、研究外源基因在动物整体水平的表达调控规律。 2、转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性研究 3、改善动物生产性能，提高动物育种效率。 4、改变动物基因使其表现型更适合人类需要，用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物质。;第二节 转基因植物;一、基本方法——技术路线;外源基因导入植物的方法;（2）基因枪法;（3）种质系统的基因导入;二、转基因植物在医学上的应用;转基因植物可成为新的疫苗来源，植物病毒也成为人类疫苗的可能来源。 优点: 植物病毒对动物不致病，利用植物病毒表达抗原蛋白的片段，以诱导哺乳动物免疫系统发生反应。 转基因植物还可以生产单抗，有公司已用转基因大豆生产出单抗BR96，作为化疗药物的靶向载体治疗乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌，目前正处于试验阶段。 ;三、存在问题 1、食品安全问题： 1）未知的可能副作用？ 2）外源基因在人体内表达？ 2、技术问题： 1）成本； 2）成功率； 3）基因组的有效整合、稳定遗传；;第三节 基因打靶;一、基因打靶的必备条件; 将H