第7章细胞重组与细胞融合.ppt

第七章 细胞重组与细胞融合;一、细胞重组 （一）概述 1 概念 通过一定的实验技术，从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其装配成具有生物活性的细胞或细胞器，又称细胞拆合。 2 特点 细胞重组最初只在细胞核、质之间的移植，现在发展到可以人为的对细胞任何的不同组分进行组合，大大扩展了在细胞工程研究中的应用。 ; 3 意义 1）研究核质关系 2）研究细胞器的功能及相互作用关系 3）研究细胞器的组装，甚至细胞的自我装配机理，以揭示细胞起源与进化的机制。 4）结合基因转移技术，可人为地使细胞表达新的性状和产生新的产物，实现掌握细胞、利用细胞、改造并进而创造出具有特定性状和功能的工程细胞。 ;（二）细胞重组技术 ★细胞重组的方式及有关概念 1）胞质体与完整细胞的融合形成胞质杂种； 2）微细胞与完整细胞的融合形成微细胞异核体； 3）胞质体与核体（小细胞）融合形成重组细胞（核质杂种） 胞质体（cytoplast,cytosome)：除去细胞核后由细胞膜包裹的结构。 小细胞（minicell ）：又称核体，具有细胞核、带有薄层细胞质。 微细胞（microcell）：含有一个微核（仅有一条或几条染色体）并带有薄层细胞质。;1 显微操作技术 在显微镜下或借助于显微操作仪，用细微玻璃针或微吸管、微电极等对细胞进行人为操作。 2 细胞分离技术 1）梯度沉降分离法 2）等密度沉降分离法 3）流式细胞仪分离法 3 细胞破碎方法 1）超声波破碎法 2）反复冻溶法 3）化学裂解法 4）高速组织倒碎法 ;4 细胞器的分离 5 胞质体、核体和微细胞的制备 最常使用方法是： 物理法结合显微操作技术 化学法结合离心技术制备 1）胞质体 首先用细胞松弛素B处理细胞诱发其排核，然后震荡离心分离得到胞质体。 2）核体 在得到胞质体的同时，离心收集排除的有完整细胞核，带有少量细胞质并围有完整细胞膜的结构便是核体。 3）微细胞 首先用秋水仙???处理，染色体停滞在有丝分裂中期，体外培养过程中，在单个染色体或染色体周缘会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。;6 细胞器拆合重组举例;二、 细胞融合(cell fusion);（二）、 细胞融合的意义（应用）;2 诱导PC染色体;（三）、细胞融合的机理;;;★ 融合机制种种;（四）、细胞融合的材料 1 植物或微生物原生质体的制备 2 动物单个细胞的获得 酶解消化法（胰蛋白酶、胶原酶）;（五）、 细胞融合的方法;2、化学法——PEG结合高Ca2+、pH诱导法;A、 基本原理 PEG(polyethylene glycol)是一种多聚化合物，分子式为H(OHCH2-CH2)nOH，平均分子量在200—20000之间。诱导机制可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的作用下形成静电键，促使原生质体间的黏着而结合，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。;B、 基本过程及注意事项 （1）亲本原生质体事先做好识别标记（色素、缺陷型、抗性标记等） （2）原生质体密度在105/ml左右，比例1：1 （3）PEG分子量通常为4000—6000，浓度50% （4）加入PEG后迅速混匀，置24℃培育10—20min，然后缓缓加入高pH、高钙离子溶液，15min后用洗涤液洗涤，离心收集。;3、物理法——电场诱导细胞融合;（六）、融合细胞的选择 1 融合体的类型 在整个融合液中，除了未融合的单亲细胞外，主要包括三种类型的融合细胞。 1）同核体——同源原生质体的融合 2）异核体——非同源原生质体的融合 3）多核体——含有双亲不同比例核物质的融合体 ;融合体的筛选方法 1）遗传互补筛选法 2）抗性互补筛选法 3）生长特性筛选法 4）物理特性筛选法 5）其他方法 ;（七）、细胞融合技术的应用举例 ; 动物细胞融合举例——单克隆抗体的制备;1 单克隆抗体的制作原理 2 单克隆抗体的制作过程 1） 动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备 2）骨髓瘤细胞的获得与培养 3） 细胞融合 4） 抗体的检测及杂交瘤的选择