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第二章 分子克隆的工具酶 2.1 限制性核酸内切酶 2.2 聚合酶 2.3 DNA连接酶 2.4 其它分子克隆工具酶 2.1 限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease) “分子剪刀”或 “分子手术刀” ? 是一类能识别双链DNA 中特殊核苷酸序列，并 使每条链的一个磷酸二 酯键断开的内脱氧核糖 核酸酶。 ? 是生物细胞内限制性修 饰系统的一部分，防止 外源DNA的入侵。 2.1 限制性核酸内切酶 2.1.1 限制与修饰 2.1.2 限制性核酸内切酶的发现与命名 2.1.3 限制性核酸内切酶的类型 2.1.4 限制性内切酶的识别序列 2.1.5 限制性内切酶的切割位点 2.1.6 限制性内切酶的切割方式 2.1.7 DNA末端长度对限制性酶切的影响 2.1.8 位点偏爱 2.1.9 酶切反应条件 2.1.10 星活性 2.1.11 酶切注意事项 2.1.12 限制酶酶切位点的引入 2.1.1 限制(restriction) 与修饰(modification) 1 寄主控制的限制与修饰现象 ： 1 (寄主控制专一性） 限制：寄主（细菌）能够识别自 己的DNA和外来的DNA，并 教材p15表2－1 使后者降解掉。 EOP (efficiency of plate)：感染率 ?修饰： 在寄主大肠杆菌K菌株生长的λ噬菌体（ λk）感染大肠杆菌 B菌株，因为受到限制，产生稀少的噬菌斑。但用这少量的噬菌 斑中的噬菌体再感染B菌株，这些噬菌体可以在B菌株上有效的生 长。B菌株赋予了λk噬菌体的这种非遗传变化，使得它再感染B菌 株时没有再次受到B菌株限制的现象，称为修饰。 核酸内切限制酶EcoRI及修饰的甲基化酶MEcoRI的限制与修饰作用 生物体内，甲基化是最常 见的修饰作用，甲基化酶 与限制酶二者对应并同时 存在。甲基化酶与对应的 限制酶识别相同的序列， 但其作用不是切割，而是 在两条链上对某个碱基进 行甲基化。 2.1.2 限制性核酸内切酶的发现与命名 ??，首次从大肠杆菌年，首次从大肠杆菌KK中分离到限制中分离到限制 酶，没有特定的切割位点（酶，没有特定的切割位点（II型）型） ??，美国的年，美国的H.H. SmithSmith首先在流感嗜血首先在流感嗜血 杆菌中发现了第一个限制性内切酶（杆菌中发现了第一个限制性内切酶（HinHindd IIII）） ??年22月，共发现了月，共发现限制酶，其中种限制酶，其中 商业化的限制酶有商业化的限制酶有609609种。种。 2.1.2 限制性核酸内切酶的发现与命名 H.O.Smith and D.Nathans(1973)年提议的命名系统 ? 用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的3个字母的略 语表示寄主菌的物种名。 如：Escherichia coli 用Eco表示。 ? 用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型，如：EcoR。 ? 以罗马字母表示同一菌株中不同的限制和修饰体系。如： EcoRI 和EcoRV （EcoRI, EcoRV)。 ? 例：Hind III 表示为从流感嗜血菌Rd 菌株（Haemophilus influenzae Rd）中分离到的第三种限制性内切酶。 教材p17表2－2 三亚基双功能 二亚基双功能