基因工程-4-PCR及文库克隆法.ppt

二 基因克隆方法 -------PCR;1、PCR技术扩增的步骤—三步曲 ;2 PCR反应的DNA聚合酶选择;第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。 第二对引物称为巢式引物，结合在第一次PCR产物内部。;3.利用PCR获得目的基因的方法;;3.2 RT-PCR方法;;3.3 RACE PCR技术;;;3.3 Tail PCR;3.3.1 Tail PCR原理;;;3.3.2 TAIL-PCR的优点;3.4 重叠延伸PCR（融合PCR）;A基因： 上游（F1）与开放阅读框起始密码子附近的序列相对应，并在5 ’末端添加酶切位点和3个保护碱基；下游（R1）与B基因终止密码子附近的序列及A基因5’末端起始密码子附近的序列互补，并去除A基因的终止密码子TAA B基因： 上游（F2）与A基因终止密码子附近的序列及B基因5 ’端起始密码子附近的序列相对应，同样去除A基因终止密码子TAA；下游（R2）与B基因的开放阅读框终止密码子序列互补，并在5’末端添加酶切位点和2个保护碱基。;3.4.2 融合PCR构建表达基因;3.4.3 重叠延伸PCR的优点： 能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物. 3.4.4 重叠延伸PCR的用途： 重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。 ;3.5.1 一步重叠延伸PCR原理;3.6 功能蛋白组分离目的基因;;3.6.2 利用简并引物扩增目的基因;3.6.3 简并引物设计实例; 二 基因克隆方法 -------文库构建法;但只要切割基因是随机的，而且克隆数目是足够大，那么构建的克隆群体救可以包含基因组内全部基因片段。因此，这样的克隆群体就象储存有基因组内各种基因的仓库，故称基因文库。;1.基因文库的分类 按DNA来源分 cDNA基因文库 基因组（染色体）基因文库  噬菌体基因库 15-20kb  按克隆载体分 柯斯质粒基因库 45kb  质粒基因库 10kb  2.理想??因文库的条件 完整性——全部基因组DNA顺序 稳定性——重组体不丢失，不重组，易保藏 易选性——保证基因组完整性和数量有限性统一;（一）cDNA文库构建基本流程;（一）、cDNA文库的建立;（1）随机引物引导法;3、第二条链的合成;（2）双链cDNA的置换合成;（3）引物-衔接头法双链DNA的合成 ;;;1.基因文库的构建规模 （取决于基因组大小和插入片段的大小）;基因组文库应具有的克隆子数;2.基因组文库构建一般流程;3.基因文库的筛选;;三、转座子突变文库;;2. 转座子标签法的主要步骤：