生物分离工程 沉淀法.ppt

16 沉 淀 法 (precipitation);生物分离过程的一般流程;什么是沉淀法？ 沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？ 常用的沉淀方法包括哪些？ 何谓盐析？其原理是什么？ 常用的盐是什么，影响盐析的主要因素有哪些？ 有机溶剂沉淀法的原理是什么？ 影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ 等电点沉析的工作原理是什么？;沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。 沉淀法的目的： 通过沉淀达到浓缩的目的； 沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步 纯化 ； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。;; 沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行：;沉淀法操作步骤 ： ①首先加入沉淀剂， ②沉淀剂的陈化，促进粒子生长； ③离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。;沉淀生成动力学;为了简化沉淀过程动力学， 可把沉淀过程分成下述６个步骤： (1) 初始混合 (2) 新相生成 (3) 布朗运动凝集 (4) 机械碰撞凝集 (5) 聚集体陈化 (6) 聚集体沉淀 ;沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产的制备过程， 是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。 优点：操作简单、经济、浓缩倍数高 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强 ;沉淀法的分类;16.1 蛋白质的溶解特性;蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域;蛋白质的溶解特性;防止蛋白质凝聚沉淀的屏障;;盐析;盐析法机理;;盐析过程;;盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济;盐析用盐的选择;;盐析操作(加盐方式）;;㏒ S=β-ＫsＩ S—蛋白??的溶解度，g/L; I－离子强度， I=1/2∑mizi2 mi—离子 i的摩尔浓度； Zi—所带电荷 β—常数，图中截距 Ks—盐析常数，图中直线斜率; β和Ks的物理意义 β—β代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关； Ks—盐析常数，代表图中直线的斜率； 从一些实验结果表明，Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过1倍。;用盐析法分离蛋白质的二种方法;虽然Cohn公式能够描述盐析状态下蛋白质的溶解度，但它不能体现低盐浓度（盐溶状态）下蛋白质的溶解度。 Melander和Horvath根据 Sinanoglu有关蛋白质盐析时溶剂和溶质相互作用理论（空腔理论）， 提出了不同盐浓度下的蛋白质溶解度的计算方程式：;;盐析用盐量的确定-饱和度：;;硫酸铵盐析过程最适饱和度是30%，55%;盐析的影响因素：3）pH值;pH值;;盐析影响因素：4）温度的影响;盐析的影响因素：5）蛋白质浓度;对起始浓度为 30g/L的COMb溶液，大部分蛋白质在硫酸铵饱和度为 58-65％之间沉淀出来； 但对稀释10倍的 COMb溶液，饱和度达到66%时才开始沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。;盐析注意事项;盐析注意事项;盐析法特点：;;等电点沉淀法;图16-10表示大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况。;;等电点沉淀法;等电点沉淀法注意事项;;概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。 优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易； 缺点是1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作要求在低温下进行。3）成本高 总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。;有机溶剂沉淀法机理;;常用的有机溶剂沉析剂;1、温度使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行， 有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋白质的变性作用，有机溶剂要缓缓加入，防止溶液局部升温。。 温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。 因此，所用的有机溶剂须预先冷却到-10－-20℃；在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行 。