细胞电生理学、膜片钳技术1.pptVIP

cell electrophysiology patch clamp techniques; ; 1991 Nobel基金会的颁奖评语：;2、膜片钳技术及其应用 ; ;膜的“流动镶嵌模型”;磷脂双层的 屏蔽作用;Na-K 泵; [K+]o [K+]i [Na+]o [Na+]i;;离子通道 (ion channels);配体门控通道 阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体 阴离子通道：甘氨酸和γ－氨基丁酸受体 ;电压门控通道：钾、钠、钙离子通道;环核苷酸门控通道 气味分子与G蛋白偶联型受体结合，激活腺苷酸环化酶，产生cAMP，开启cAMP门控阳离子通道（cAMP-gated cation channel），引起钠离子内流，膜去极化，产生神经冲动，最终形成嗅觉或味觉。 机械门控通道 一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后者仅发现??内皮细胞和心肌细胞 水通道 2003年诺贝尔化学奖： Pete Agre、 Roderick MacKinnon;2、膜片钳技术及其应用;电生理学研究简史：;1937年，Hodgkin和Huxley在枪乌贼巨大神经轴突细胞内实现细胞内电记录，获1963年Nobel奖。 1946年，凌宁和Gerard创造拉制出尖端直径小于1μm的玻璃微电极，并记录了骨骼肌的电活动。玻璃微电极的应用使的电生理研究进行了革命性的变化。 Voltage clamp（电压钳技术）由Cole和Marmont 发明，并很快由Hodgkin和Huxley完善，真正开始了定量研究，建立了H－H模型（膜离子学说),是近代兴奋学说的基石。 ;1948年，Katz利用细胞内微电极技术记录到了终板电位；1969年，又证实N－M接触后的Ach以“量子式”释放，获1976年Nobel奖。 1976年，德国的Neher和Sakmann发明Patch Clamp（膜片钳）。并在蛙横纹肌终板部位记录到乙酰胆碱引起的通道电流。 1980年，Sigworth、 Hamill、Neher等在记录电极内施加负压吸引，得到了10~100 GΩ的高阻封接(giga seal)，大大降低记录噪声，实现了单根电极既钳制膜电位又记录单通道电流。获1991年Nobel奖。 ;History of Ion Channel Study;1963年诺贝尔生理学/医学奖发现了神经细胞膜的周边和中央部分与兴奋和抑制有关的离子机制;The Nobel Prize in Physiology or Medicine (1991) ;膜片钳技术;基本原理; 膜片钳技术实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻（ 10ＧΩ ）密封,使电极尖端开口处相接的细胞膜片与周围环境在电学上隔离,并通过外加命令电压钳制膜电位。;;膜片钳技术的优点;膜片钳记录的各种模式;;Patch clamp-whole cell;;细胞吸附膜片(cell-attached patch mode);内面向外膜片(inside-out patch);全细胞记录式(Ｗhole-cell recording);外面向外膜片(outside-out patch);开放细胞吸附膜内面向外模式（open cell-attached inside-out mode）;穿孔膜片模式（perforated patch mode）;穿孔囊泡膜外面向外模式(perforated vesicle outside-out mode);过去认为，膜片钳只能在培养细胞或酶解的细胞上进行，这样得到的细胞膜表面比较光滑，才能够形成高阻封接，但缺点是组织的正常三维结构被破坏，并且对神经中枢内突触特有的传递机能的研究无法展开。于是，一些学者建立了组织切片膜片钳技术（Slice patch），就能在哺乳动物脑片制备上做全细胞记录。;1992年，在脑片膜片钳技术上，美国Ferster 实验室首次报道在在体猫的视皮层用膜片钳全细胞记录研究了视刺激诱发的兴奋性和抑制性突触后电位相互影响及节律性膜电位的变化规律。;;;膜片钳技术的应用;用以检测某些递质能否打开通道(外面向外膜片),或是否接受第二信使的调控(内面向外膜片); 研究腺苷酸环化酶、多磷酸磷脂酰肌醇激酶、蛋白激酶Ｃ等活性变化,以及细胞膜上信使物质二酰甘油花生四烯酸等对离子通道型受体的调节机制(应用全细胞钳或外面向外膜片); 研究受