线路三shRNA表达载体和病毒载体.PDFVIP

线路三：shRNA 表达载体和病毒载体 1. shRNA 表达质粒载体 载体。 siRNA 直接转染可以方便地实现顺时基 最方便的莫过于 Sigma 公司的 MISSION 因沉默，通常持续时间在 3 天-7 天左右，因 ? shRNA Libraries。这个由麻省理工和哈佛等 目标基因差别而异。对于一些半衰期很长的蛋 11 个著名研究所及制药公司组成的 RNAi 协 白，要想观察蛋白表达下降对细胞表型的长期 会（The RNAi Consortium, TRC）所研发，共 影响就需要长期研究目标基因沉默的效果， 包括靶向人类 15000 个基因和小鼠的 15, 000 shRNA 表达载体是更适合的选择。 个基因，针对每个基因有 3-5 个不同位点的 什么是 shRNA(short hairpin RNA)？就是 shRNA 克隆，共计 15 万个预制的 shRNA 克 目标 siRNA 与其反向互补序列之间由特定的 隆，每个克隆都经过测序验证，即买即用，不 连接序列间隔，得到的 RNA 两端反向互补退 需要自己费时间设计 shRNA，合 成 Oligo、克 火，与连接序列形成茎环结构，类似发夹。携 隆构建载体、筛选测序什么的，方便之极。如 带目标基因 shRNA 的表达载体转染或者转导 果你的目标是尽快得到研究结果，而不是在实 到目标细胞中，载体表达 shRNA 并被 Dicer 验过程中学习如何成为 shRNA 设计克隆专 酶切割为 siRNA，就可以引发目标基因的沉 家，那么就全力以赴实验目标，尽快发表结果 默（参考前面的图中线路 3）。shRNA 表达 吧，这些事情交给 TRC 和 Sigma 去做好了， 载体可分为质粒载体和病毒载体。 时间就是金钱。pLKO.1-puro 质粒由 U6 启动 shRNA 载体最大的优势是利用载体上的 子引导 shRNA 的合成，由于载体上还携带了 抗生素标记可以建立相对稳定的长期基因沉 由 hPKG 启动子引导的 puromycin 抗性筛选标 默细胞株，或者通过病毒插入基因组中从而得 记，这个启动子比 U6 弱，可以借助筛选压力 到稳定的基因沉默表达株。此外，载体上的抗 促进 shRNA 的表达，可直接用于转染细胞进 生素筛选还可以排除未转染的细胞，以避免混 行 RNAi 实验。妙的是这个载体本身也是慢病 杂的未转染细胞中的目标基因 mRNA 干扰后 毒就是 Transfer 载体，如果发现你的细胞用常 继的定量检测结果。此外，除了可以做长期基 规的方法都转染不了，也可以借助 Sigma 特 因沉默，有的质粒载体设计是可重复使用的。 定的包装试剂盒制备慢病毒颗粒----慢病毒几 这个 shRNA 方法虽然目标是 RNA，但在检测 乎可以对付绝大多数顽固的细胞株，包括静止 以前整个过程却不涉及 RNA 操作，挺有趣的。 期细胞，而且转染效率达到 100%。由于质粒 不过，构建 shRNA 表达载体是相当麻烦 可以复制扩增，如果需要重复大量使用