第8章 PCR技术及其应用.pdfVIP

第8章 PCR技术及其应用 nPCR技术原理和工作方式 nPCR产物的克隆 nPCR扩增未知DNA片段 n与反转录相关的PCR 8.1 PCR技术原理和工作方式 8.1.1 PCR的基本原理 ⒈基本要素 n DNA模板， 寡核苷酸作引物 DNA聚合酶 dNTP n PCR扩增每一轮包括3个步骤:变性、退火和延伸。 1 ⒉ PCR扩增的步骤 n 变性（denaturation）：将模板DNA置于92- 96℃，使dsDNA在高温下解链成为ssDNA，且热变 性不改变其化学性质； n 退火（annealing）：将温度降至37-72℃，使引 物与模板的互补区相结合； n 延伸（extension）：在72℃条件下，DNA聚合酶 将dNTP连续加到引物的3‘-OH端，合成DNA。 n 这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过20- 40个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列 的DNA片段。 3. PCR的基本原理 n扩增原理(动画） 2 8.1.2 PCR反应体系 ⒈缓冲液 n 标准的缓冲液含10 mM Tris·HCl，pH为8.3-9.0 （室温），而在延伸温度（72℃）下pH接近7.2。 缓冲液中含有Mg2+或Mn2+，用于激活DNA聚合酶的 活性中心。标准Mg2+浓度为1.5 mM。 ⒉脱氧三磷酸核苷 n 脱氧核苷三磷酸是DNA合成的底物，标准的PCR反 应体系中含有等摩尔浓度的4种dNTP，即dATP、 dTTP、dCTP和dGTP，终浓度一般为200 μM（即饱 和浓度）。 n dNTP的浓度会影响扩增的产量、特异性 （specificity）和保真度（fidelity）。 3 ⒊引物 n 在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各1 μM，即1pmol/μl，在100 μl反应体系中相当于 6x1013个分子。如果5%用于扩增1 kb的DNA片段， 可得到3.3 μg的产物，足以用于常规分析。 引物设计要考虑的几个问题 ①长度：至少16 bp，通常为18-30 bp，更短的引 物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有 效性。 ② 解链温度（Tm值）???两个引物之间的Tm值差异 最好在2-5℃。 ③避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱 基） ④ G＋C含量尽量控制在40%-60%之间，4种碱基的 分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续 排列，以及T在3′末端的重复排列。 ⑤ 引物的3′末端最好是G或C，但不要GC连排。 4 ⒋模板 n 模板的数量会直接影响扩增的效果。对于一般 的PCR扩增，104至107个模板分子可达到满意的 效果。 ⒌ DNA聚合酶 ⑴ Taq DNA聚合酶 n 来自嗜热古细菌的嗜热水生菌（Thermus aquaticus） n Taq DNA聚合酶分子量大小为94 kDa，为单分子 酶，在75℃活性最强。具有5’→3’合成活性和 5’→3’外切活性，但是无3’→5’外切活性。 n 没有校正能力，因此运用Taq酶进行PCR，产 物中点突变较多，对克隆等不太有利。 n 在95℃的半衰期为40分钟。启动PCR反应的能力很 强，聚合速度快，在72℃的聚合速度为每秒30- 100碱基。 5 ⑵ TthDNA聚合酶 来自嗜热热细菌（Thermusthermophilus）HB8， 由Promega公司开发成商品。 ⑶ Vent DNA聚合酶 美国New England Biolabs公司从潜水艇排气孔 （Ven