ACE抑制肽测定分析.doc

实验方案 小麦胚芽超临界二氧化碳脱脂 将小麦胚芽均匀平铺于不锈钢铁盘中，至于120度烘箱中烘30分钟钝化脂肪酶并除去水分，然后超临界二氧化碳脱脂。脱脂条件为萃取压力：35Mpa,萃取温度35摄氏度，萃取时间150分钟，常压分离。 用到的仪器：超临界萃取装置，烘箱 麦胚蛋白的提取 将脱脂麦胚用粉碎机粉碎幷过100目筛，称取一定量的脱脂麦胚用蒸馏水溶解，调PH至9.5，与恒温磁力搅拌器上搅拌30分钟，使其充分溶解。然后4000转/min离心10分钟，取上清液，调PH到4.0沉淀蛋白质。再用60%乙醇洗涤两次取出醇溶蛋白质和色素类物质，并调PH回7.0，冷冻干燥备用。 用到的装置，仪器，材料：粉碎机，100目筛，蒸馏水，磷酸盐缓冲液，酸度计，磁力搅拌器，离心机，乙醇，真空冷冻干燥机。 超声波辅助法制取ACE抑制肽 将麦胚蛋白按料水比1:10（g/ml）配制，放入塑料容器中，用1mol/lNaOH调PH至11，利用超声波对料液进行预处理30分钟，（水浴温度55度，超声波频率50HZ，超声波功率200W），测定PH值，之后直接按酶与底物5%添加Alcalase酶，继续在水浴中反应两小时，之后在85摄氏度下灭酶10min,在12000r/min离心5min,所得上清液进行抽滤，所得酶解液进行冷冻干燥，备用。 用到的仪器等：超声波清洗器，超速离心机，酸度计，塑料杯等。 用大孔吸附树脂分离纯化麦胚ACE抑制肽 3 种大孔树脂的型号及物理参数 编号树脂型号 外观特征 极性 比表面积/(m2/g) 平均孔径/A 1 DA201-C 棕色球状 非极性 1000～1300 40 2 XAD1600 白色球状 弱极性 800 150 3 XAD7HP 白色球状 弱极性 500 450 树脂的活化及预处理 首先使用2BV 无水乙醇浸泡树脂24h，使其充分溶胀，然后将树脂装柱，用8～10BV 无水乙醇以3～4BV/h的流速通过树脂层，至流出液在波长220nm 处吸光度小于0 .1 (以无水乙醇为空白对照)，乙醇处理后，以6 ～8BV/h 流速的去离子水置换出树脂中的乙醇，直至流出液无乙醇味即可投入使用。 静态吸附实验筛选树脂 于250mL 具塞锥形瓶中加入10g 预先处理过的树脂，再加入50mL 10mg/mL 酶解产物溶液，调pH5，放入25℃恒温水浴摇床中振荡(150 次/min)。于20、40、6 0 、8 0 、9 5 、1 1 0 、1 2 5 、1 4 0 、1 6 0 、1 8 0 、2 1 0 ???240min 分别取样，采用Folin- 酚法测定其多肽含量，分别计算3 种大孔吸附树脂的吸附率。 吸附率/% =（原液蛋白质质量浓度－吸附后水解液蛋白质质量浓度）/原液蛋白质质量浓度× 100 用到的仪器材料等：三种树脂，无水乙醇，去离子水，具塞锥形瓶，水浴摇床，锥形瓶若干。 蛋白含量测定、ACE抑制肽含量测定、ACE抑制肽活性测定方法 检测方法： 固体蛋白含量测定方法，用凯氏定氮仪测定 ACE抑制肽含量测定：高效液相色谱法测定 （3）ACE抑制肽体外活性检测：马尿酸法测定ACE 体外抑制活性 六、固体蛋白含量测定 1、样品处理 称取约2g样品（精确至0.0001g），完全溶解后转移至100ml容量瓶中定容，混匀后吸取10ml放入具塞比色管中，再加入10ml 15%三氯乙酸溶液，混合均匀，静置沉降5min后，将其倒入离心管中，在4000r/min下离心10min，取其上清液倒入另一只比 色管中。 2、试样消化 吸取10ml离心清液移入凯氏烧瓶中，加入一包混合催化剂及25ml硫酸.. -过氧化氢-水混合液，稍加振摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜放于电炉上，在通风橱内加热进行消化。开始时用低温加热，勿使瓶中泡沫超过瓶肚的2/3，待泡沫减少、 烟雾变白、内容物均匀后再增加温度保持液面微沸。消化至溶液呈蓝绿色的透明状时，再继续加热，沸腾10min后，取下凯氏烧瓶冷却至约40℃，缓慢加入25ml蒸馏水，摇匀，冷却至室温。 蒸馏 将消化完毕并冷却至室温的消化液全部转移到100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。向凯氏半微量定氮蒸馏装置的烧瓶内加2/3的水及数粒玻璃珠，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，并检查凯氏半微量定氮蒸馏装置有无漏气处。向接收瓶内加入20ml 2%硼酸溶液和2滴混合指示剂，将接收瓶置于蒸馏装置的冷凝管下端，使冷凝管下端插入硼酸液面下1cm处。准确吸取10ml稀释定容后的消化液，沿小玻璃杯移入反应室，并加10ml蒸馏水冲洗小玻璃杯，一并移入反应室，塞紧棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯中，提起玻璃塞使其缓