免疫组化技术在病理诊断及研究中的应用.pptVIP

免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用;引言： 1842年BeNNeftt首先提出了“组织学”，同时virchow作了大量正常和病理组织显微镜研究，于1856年发表了“细胞病理学”。百余年来组织病理学进展很快，但在应用和解释形态学标准时仍有困难，单靠组织切片检查有时并不能作出全面的诊断，随之发展了特殊染色和各种组化技术，为病理诊断提供了新的参考依据。1941年由cooN等建立的荧光抗体在组织切片中检测细胞抗原的技术，首次提供了一种根据细胞抗原及细胞产物来识别细胞的手段，这种手段在病理的某些领域，尤其是肾脏病、皮肤病的研究中取得了非常大的成功。; 但在外科病理学中并未得到推广，主要是由于该方法需要新鲜组织作冰冻切片，并只能获得较少的形态学特征，这对于传统的根据细胞形态学的特征，有时甚至是极细微的表现来识别细胞和诊断肿瘤的外科病理学家来说无疑是一大障碍。尽管荧光抗体技术并未在肿瘤研究中得到广泛应用，但由于其简便而快速的特点，在肾小球肾炎、皮肤病的研究中仍发挥着重要的作用。 ; 1966年NakaNe和Averameas等建立了免疫酶标技术，1970年seerNberger等人发展了一种过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)技术，1975年Kohler和MilsteiN建立了杂交瘤制备单克隆抗体技术，这些对于外科病理的发展是一个重大的技术里程碑。随着辣根过氧化物酶代替荧光素异硫氰酸盐，作为初级抗体的标记物，一种全新的信号分子得到了应用，在辣根过氧化物酶中加入显色的底物进行染色，产生一种能被普遍光镜所观察的稳定显色反应。酶免疫组化法对于病理学家诊断肿瘤、对其分类、判断预后产生了巨大的影响，同时也扩展了人们对于各种疾病与肿瘤形成过程的认识，提高了病理诊断与研究水平。 ;一、 免疫组化技术 利用能与特异性抗体结合的酶，在酶-抗体-抗原反应的位点上诱导通过底物或显色剂而完成的变色反应。辣根过氧化物酶是免疫酶学的原型，其它酶系统如葡萄糖氧化酶，碱性磷酸酶也被成功应用。 ;酶桥法： 利用酶联抗体将酶与组织切片中抗原相结合，通过与适当底物反应（通常是H2O2）以及二氨基联苯胺(diamiNobeNzidiNe DAB)的显色剂，产生一种不溶性棕色反应产物。该法已被进一步改进发展为更敏感的多级桥联法，后者利于增加在抗原部位反应产物的沉积。 ; PAP法是过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)复合物，包括辣根过氧化物酶抗体，及辣根过氧化物酶抗原组成的可溶性复合物为五环状结构，3个分子辣根过氧化物酶和二个抗体分子组成，极为稳定，比免疫荧光法敏感100-1000倍，比酶桥法敏感20倍，其原理是特异性初级抗体（一抗）的Fab段与组织抗原结合，二抗（桥抗）在一抗与PAP复合物之间形成分子桥联，此时一抗与PAP中的免疫球蛋必须是同一种属，以使得衍生自其它种属的二抗，对一抗分子PAP中的FC段及稳定成份都具有特异性。; 由于免疫酶学技术普遍使用辣根过氧化物酶，因此组织切片中内源性过氧化物酶一开始就必须用H2O2或H2O2和甲醇组成的混合物加以灭活，并通过与桥抗同一种属来源的非免疫稀释血清阻断非特异性结合，足够的桥抗使所有游离抗原结合位点都能与PAP复合物连接，并在加入PAP可溶性复合物到组织切片中反应之前洗去未结合的桥抗，最后使PAP复合物与底物及显色剂反应， 以产生能被普通光镜所见到的不溶性棕色产物，以此识别组织切片中抗原所在的位置。;; 免疫酶学技术还包括碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APA-AP)系统[2] 及葡萄糖氧化酶─抗葡萄糖氧化酶（GAG)系统等，这些技术与PAP技术相似，只不过是将碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶代替辣根过氧化物酶而已，据称这两种技术可以减少背景染色的干扰，因为相应的内源性酶在组织中分布有限，尤其是APA -AP技术更适用于血液标本染色。; 生物素是一种低分子量的维生素，可以与一抗共价结合。亲合素是一种从卵白素中提取的具有4 个生物素结合位点的糖蛋白，这一特性能使之成为多级免疫酶学系统各成分之间的桥接物。1981年Hsu 等人建立了卵白素-生物素-过氧化物酶(AvidiN BiotiN-peroxidase Complex ABC)系统。该方法是通过生物素相关的次级抗体将一抗连接到卵白素-生物素-过氧化物酶复合物上，结果产生的复合物是一种点阵样、三维构造的复合物，有助于将多个辣根过氧化物酶分子结合于切片中的一个抗原所在的位点上，因此比PAP法更灵敏，约比PAP法敏感8-40倍，特异性强、非特异性背景着色低、方法简便、应用广。 ; ABC系统通过将链球菌抗生物素蛋白代替抗生物素蛋白而得到进一步改进，称为链球菌抗生物素蛋