疏水層析7组.pptVIP

 疏水作用层析;疏水层析的概念 疏水层析的原理 疏水层析过程 影响疏水层析的因素 疏水层析的应用 疏水层析的发展趋势 ;疏水层析的概念;疏水层析原理：;三、疏水层析过程;; 3．装柱 将选定的亲水性吸附剂如苯基-Sepharose C1-4B悬浮于乙醇溶液中，浸泡一段时间； 采用离心(或过滤)方法，弃上清液，收集沉淀物； 并以50％(m／V)浓度悬浮于样品缓冲液中； 尔后，按常规方法装入层析柱，经洗涤、平衡完毕，即可加样。 ;;疏水作用层析过程的参数 ;疏水层析的影响因素： 1、盐类和盐组成 盐的摩尔表面张力增大，蛋白质在疏水层析柱内的吸附能力相应增大。 各种盐离子和离子对具有破坏周围水分子有序排列的能力。 流动相中盐的组成对蛋白质在疏水层析介质上的吸附能力具有最为重大的影响。 选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分离后蛋白质的活性都很重要。硫酸铵、醋酸铵、氯化钠和磷酸盐是疏水层析分离常用的几种盐。;2、离子强度 离子强度的大小直接影响样品组分在固定相的保留值。一般增加离子强度来增加组分的保留值，降低离子强度来提高组分的解析附能力。 HIC实验中，改变离子强度进行洗脱的方式，一般宜采用梯度洗脱法，可提高分离的选择性。 3、溶液的酸碱度 溶液的pH值主要考虑能维持生物大分子生物活性的pH环境。一般情况，溶液的pH接近蛋白质的等电点，其疏水性增加，有利于与固定相配基相互作用；远离其等电点，其疏水性减少，不利于与固定相配基结合，但有利于蛋白质洗脱。因此通过改变溶液的pH也可以改变蛋白质的疏水性。 4、柱温 一般柱温升高，生物大分子的构象会发生变化，疏水作用增加，吸附能力增加，有利于提高层析柱的分离度，所以有时可以通过提高柱温来增加疏水基团与配基间的相互作用，分离性质相近的化合物，如对分离一些小分子是非常有效的。但是对于具有生物活性的物质或酶类，在高温条件下易变性失活，因此不宜在高温条件下进行分离。一般都在常温或低温下操作。 ;排在最左边的离子，盐析作用（蛋白质溶解度低）最强，洗脱能力最弱；即疏水作用强 排在最右边的离子，洗脱能力最强，盐析作用最弱。;技术;介质（基质+配基）; HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，与反相层析介质相比，其烷基通常在C8以下，芳香基多为苯基。 ;偶联至基质的常见配基类型 （A）丁基，（B）辛基，（C）苯基，（D）新戊基 ;对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力太强，为洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙二醇等)不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。;介质的选择：;样品的准备：;层析条件的优化：;流动相A与流动相B ;洗脱的方式：;层析介质的再生、贮存 ：;应用; 近年来，随着层析技术的发展，与HIC相关的其它层析技术也得到了发展，主要有以下两种： 1）亲硫性疏水层析(thio—philic chromatography) 2）疏水电荷诱导层析 (HCIC) ;亲硫性疏水层析;疏水电荷诱导层析(HCIC) ; 通常HCIC的配基中含有吡啶环，中性时不会带有电荷，而随着pH值的降低，吡啶环中的氮原子会带有正电荷，这样和带同样电荷的蛋白质发生排斥，从而实现解吸（机理如图）； 另外，为了能在低盐浓度甚至无盐时对蛋白质进行吸附，其配基密度比HIC要高； 同时为了增加其选择性，配基结构??还常常含有硫。 ; HCIC主要用于抗体的分离纯化 ，具有价格低、效率高、化学稳定性强(可用lmol／L NaOH清洗)、适用范围广(可用于IgG，IgA，IgE，IgM和抗体片段的分离)的特点，目前，已有商品化的介质，如Ciphergen公司生产的MEPHyperCell； 由于HCIC比HIC、IEC拥有更温和的吸附和洗脱条件，在蛋白质类的分离上应用前景广阔。 ;总结;谢谢！