第05章代谢物酶法技术材料.ppt

第五章 代谢物酶法分析技术;教学目标与要求;代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。 ;目　录 ; 代谢物酶法分析;平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（1%～5%）时，指示反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称为终点法(end-point method)。;积分得： ;若反应达到平衡，假设 ，即 [S0]－[St] ≈ [S0]， ;若 [S0] Km ; 　标准管的 [S0－St] 与待测管的 [S0－St] 分别代表消耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光度来表示（As和Au）。标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示为Cs和Cu。;当 [S0]－[St] ≈ [S0]，即反应基本达到平衡，Au和As基本稳定不变，此时测定误差最小。如果存在基质效应，两者反应程度不一，若按上式计算就会带来误差。;速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的消耗量较小时(5%)，酶促反应呈一级反应，此时的反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。;根据米氏方程： ;若同时带标准管，则有：;在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 5%，只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固定时间法(fixed assay)。 ;平衡法的开始一段时间都有可能遵循一级反应规律。相反，速率法只要时间足够长，也会达到平衡。对于平衡法来说关键是确定达到平衡所需的时间。对于速率法来说关键是如何使酶促反应成一级反应。;酶作用的特异性高，血清等体液样品不需预处理就能测定，简化了实验程序； 试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品对环境的污染； 酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。 ;待测物与产物在理化性质上有便于检测的信号，如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析的方法称为直接法。 ;单底物反应直接测定法 ;双底物反应直接测定法 ;在340 nm 处测定吸光度的增加来进行定量的方法;酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的的方法称酶促偶联法。 ;脱氢酶指示系统 ;脱氢酶指示系统 ;脱氢酶指示系统 ;脱氢酶指示系统 ;常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。;过氧化物酶指示系统 ;过氧化物酶指示系统 ;化学名;　　利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。 ;使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质(或其衍生物)或靶物质的氧化产物作为底物循环。;产物循环－氧化酶－脱氢酶系统 ;底物循环－脱氢酶－辅酶系统;底物循环－脱氢酶－辅酶系统;氨循环－合成酶－脱氢酶系统 ;酶循环法具有的特点 ;酶活性恢复法 ;异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子 ;酶活性恢复法应用举例;激活和抑制法 ;试剂酶质量;试剂酶是指作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性的一类酶。它是酶试剂的核心，它的质量是酶试剂质量的决定性因素。;主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。基因重组酶蛋白也有应用，活力高，杂酶含量少且价格低廉。 ;不同的酶试剂系统对试剂酶的纯度有不同的要求。???NAD(P)H为指示反应中，要求试剂酶有较高的纯度。而在Trinder反应中要求相对低一些。 ;表5-2常用试剂酶的理化特征及质量要求 ;名称;名称;所用试剂酶的特异性：指示酶要有更高特异性； 怎样消除干扰因素：加消除剂、抑制剂和用双试剂法； 试剂中的附加剂：应不抑制酶的活性，不影响试剂的稳定性，不与底物和体液中的物质作用； 如何提高灵敏度：①用PMS或黄递酶，将NADH上的氢交给四氮唑盐，在可见光监测； ②用酶循环法； ③测定荧光法。;酶的用量要足够大，能使反应1 min～3 min 达到平衡，以保证较快完成测定。 反应要朝正反应方向进行，如果反应的平衡常数太低，可用增加底物浓度、偶联反应移去生成物、改变反应pH 等方法,并设标准管一起到达平衡以后测定。 Km 在保证测定线性的前提下要尽量小。;所用酶的 Km 应足够大，以保证测定线性和较长的反应动态期。Km 太小，可加入竞争性抑制剂加大 Km。 酶用量要合适，用少了可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。一般认为酶用量比平衡法小。 速率法酶促反应受很多因素影响，只有很好控制反应速度（v）才与代测物的浓度成正比例。;区别;【小结】;【小结】;【展望】;谢谢！