SDS碱裂解法制备质粒DNA.docVIP

SDS碱裂解法制备质粒DNA：小量制备（分子克隆） 1．5ml LB (或添加相应抗生素)接菌，过夜培养37℃ 250rpm 2. 离心菌体，12000rpm 30s 或 8000rpm 5min 3．弃上清，尽可能吸干培养液，加100μl Solution  = 1 \* ROMAN I(预冷)（+5μl RNaseA），vortex，重悬菌体 4．加200μl solution = 2 \* ROMAN II （新鲜配制），快速颠倒5次，勿振荡，室温放置≤5分钟 5．加150μl solution = 3 \* ROMAN III （预冷），颠倒数次，冰上放置3－5分钟 6．12000rpm 15min 上清转移到新管中 7．上清加等体积酚：氯仿（1：1），振荡混合，12000rpm 5min 离心，吸上清到新管，重复抽提至中间无白色 8．上清加2－3倍体积无水乙醇＋1/10体积NH4Ac ，混匀，冰上（或-20℃）放置15min，12000rpm离心15min 9．小心倒去上清，加500μl－1ml 70%乙醇，冲洗DNA沉淀，不要将沉淀吹起，若吹起沉淀，则应重新离心 10．37℃培养箱放置5－10min ，开口平放，吹干酒精 11．溶于适量TE(可在TE中加RNaseA消化RNA，或于Solution  = 1 \* ROMAN I中加RNaseA过程中消化RNA) 12．电泳检测 附： 1．LB培养基 酵母粉（膏） 0.5g 蛋白胨 1.0g NaCl 1.0g 水 100ml pH7.2～7.4 固体培养基加琼脂粉1.5～2.0g 灭菌：121℃(0.1MPa) 20min 常用抗生素浓度： Amp 母液浓度为 100 mg/ml in 水 工作浓度为100μg/ml （100ml LB+100μl Amp） Chl 母液浓度为 20 mg/ml in 乙醇 工作浓度为100μg/ml （100ml LB+500μl Chl） Kan 母液浓度为 10 mg/ml in 水 工作浓度为50μg/ml （100ml LB+500μl Kan） Tet 母液浓度为 5 mg/ml in 水 工作浓度为10μg/ml （100ml LB+200μl Tet）μμ 2．TE： Tris－HCl 10mmol/L EDTA 1mmol/L （pH8.0）需灭菌 取母液 Tris－HCl（pH8.0） 1M 1ml EDTA （pH8.0） 0.5M 0.2ml 加水至100ml （母液最好也灭菌） 3．质粒提取solution  = 1 \* ROMAN I：50mM Glu 25mM Tris－HCl（pH8.0） 10mM EDTA （pH8.0） 灭菌 105℃ 4℃保存 取母液： Glu 1M 10ml Tris－HCl（pH8.0） 1M 5ml EDTA （pH8.0） 0.5M 4ml 加水至 200ml 4．质粒提取solution = 2 \* ROMAN II: 0.2M NaOH --1%SDS（m/V）现用现配，室温下使用 配制0.4M NaOH 2%SDS 1：1混合 0.4M NaOH 100ml 取1.6g 2%SDS 100ml 取2g 5．质粒提取solution = 3 \* ROMAN III: 4℃保存 配5M KAc： 取29.442g KAc 配60ml 再加HAc 11.5ml 水 28.5ml 用HCl调pH4.8 定容100ml