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大鼠外周血淋巴细胞分离方法 1. 实验前准备 2. 使用方法说明及图例 2.1 血液样本分离液使用说明及图例 3. HES-TBD550使用说明 4. 注意事项 5. 性能指标 6. 细胞计数方法与要点 7. 初学者易犯的错误 8. 生产企业 9. 参考文献 1. 实验前准备 A． 试剂 大鼠外周血淋巴细胞分离液、全血及组织稀释液、细胞洗涤液、羟乙基淀粉550、胎 牛血清 B． 器材 玻璃离心管、玻璃滴管 水平转子离心机、无菌工作台 2. 使用方法说明及图例 2.1 血液样本分离液使用说明及图例 A. 小量分离-使用1-2ml新鲜抗凝血（分离图例见图例1）： a. 取新鲜抗凝血1-2ml，与全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）1:1 混匀； b. 小心加于与混合液等体积的细胞分离液（货号：LTS1083）之液面上； c. 以400g（约1500转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)； 此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色淋 巴细胞层。第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层。收集第二层细胞放入含4- 5ml细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心 20分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。 B. 中量分离-使用5-10ml新鲜抗凝血（分离图例见图例1）： a. 取新鲜抗凝血5-10ml，与全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）1:1 混匀； b. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2：1）； c. 以500g（约1800转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)； 此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色淋 巴细胞层。第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层。收集第二层细胞放入含10ml 细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20 分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。 C. 大量分离I-使用20ml新鲜抗凝血（分离图例见图例2）： a. 取新鲜抗凝血20ml以200g（约1100转/分）离心20分钟弃去血浆； b. 向弃去血浆的血细胞中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）12ml 小心混匀； c. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2：1）； d. 以600g（约2000转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)； 此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色淋 巴细胞层。第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层。收集第二层细胞放入含20ml 细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20 分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。 D. 大量分离II-使用50ml新鲜抗凝血（分离图例见图例3）： a. 取新鲜抗凝血50ml与羟乙基淀粉550（HES- TBD550）液1:1混合后再与1份注射用生理盐水混匀20℃-30℃静置20- 30分钟。吸取混浊的上清液备用，弃去底部红细胞。 b. 将步骤1中留取的上清液以200g（约1100转/分）离心20分钟弃去上清保留沉淀细胞； c. 向沉淀的细胞中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）20ml 小心混匀； d. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2：1）； e. 以600g（约2000转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)； 此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色淋 巴细胞层。第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层。收集第二层细胞放入含20ml 细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20 分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需淋巴细胞。 注：提取率大于90%。 ? 血液（人）中各细胞含量参考值： 红细胞 男：4.0-5.5×1012/L(400-550万个/mm3) 女：3.5-5.0×1012