第八章酶分子的定向进化材料.pptVIP

第 八章 酶分子的定向进化;第一节　简介;二、基本原理 对酶分子的研究可分为认识和改造两个方面。对酶分子的改造着重在两个方面： 通过各种方法对天然酶或其突变体进行研究，获得酶分子的各类信息，以此为依据对酶分子进行改造，这就是基于序列的合理化设计方案（sequential rational design），如化学修饰、定点突变等。 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基因重组、定向筛选等方法对酶进行改造，即利用基因的可操作性，模拟自然界的演化过程的非合理设计方案（irrational design），如定向进化、杂合进化等。 酶分子的定向进化（directed evolution）即属于蛋白质的非合理设计。;三、发展方向 酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业化要求，天然酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其他性质。因此，对天然酶分子水平上的改造，显得十分重要。 酶分子仍具有巨大的进化潜力，是酶的体外定向进化的基本先决条件。 酶分子存在进化潜力的主要原因如下： 天然酶在生物体内存在的环境与酶的实际应用环境不同 实际应用中，期待酶的活力和稳定性越高越好，但在生物体内对环境适应的进化主要表现在整体的适应能力、调控能力的增强 某些酶或蛋白质待进化的性质不是在生物体内所涉及的，如对蛋白质药物改造消除其副作用;酶分子的定向进化是从一个或多个已经存在的亲本酶（天然或人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。 其原理如图8－1：;四、定向进化的选择策略 虽然采用进化方法可提供新的有价值酶，即已经存在有足够大的突变库，但酶的功能突变常常被埋没在众多的中生突变和不利突变群中。 采用回交（backcrossing）法，将已进化的子代突变酶基因与野生酶基因组重组，可以排除这种干扰。 筛选或选择在酶的体外定向进化中至关重要，直接关系到定向进化的成败。因此，筛选方法必须灵敏，至少与目的性质相关;第二节　酶分子定向进化的历史;一、萌芽阶段;二、奠基阶段;三、发展阶段;第三节　定向进化的策略;一、易错PCR技术为代表的无性进化;二、DNA改组技术为代表的有性进化;;其他有性进化;三、基因家族之间的同源重组;四、外显子改组;五、杂合酶;2.研究杂合酶的意义与应用;3.展望;六、计算机辅助设计;七、突变库的构建及应用;（二）构建突变文库的载体系统;2.质粒载体系统;3.哺乳类细胞表达载体;（三）文库的筛选;（四）基因文库技术在功能基因组学研究中的应用;第四节　定向进化的应用;二、提高酶分子的稳定性 提高酶分子的稳定性，尤其是热稳定性，是蛋白质研究人员另一个最基本的愿望 在热稳定性的定向进化中，筛选比选择更加有效;三、适应人工环境中提高酶活力或稳定性 利用有机溶剂可以提高底物的溶解度或提高专一反应的速率，而天然酶在有机溶剂中极易失活，因此在酶分子的应用环境中对酶分子定向进化就十分必要 有时需要将常温生物中的酶在低温中应用，这就应该提高常温酶在低温条件下的活力 酶在应用于洗涤剂工业中时，必须在螯合剂存在环境中保持活力，因此有必要改变大多数应用的蛋白酶依赖金属离子来保持其活力或稳定性的特性;四、提高底物的专一性和增加对新底物催化活力 提高底物专一性，可以使酶更加适应工业化生产，而底物专一性是可以通过进化来提高的 利用结合能力来代替催化??力进行筛选的不利之处是，有时提高结合能力超出了酶反应所需最适值，反而降低酶的催化效率 五、对映体选择性的定向进化 定向进化可以提高R－转氨酶的对映体选择性;六、变换催化反应专一性 最近研究表明，立体选择性酶的专一性是可以变化的，也就是酶的柔性，利用定向进化方法可以改变酶的专一性 调整酶的底物专一性对于合理化设计而言是十分困难的，但对于定向进化却是一种比较容易达到的目的 ;第五节　总结与展望;酶的体外定向进化，使在自然界需要几百万年的进化过程缩短为几年、几个月甚至更短的时间，这无疑是蛋白质工程技术发展的一大飞跃 表8－1列举了一些酶定向进化的可喜结果：;酶体外定向进化的突出优点;为提高酶体外定向进化的成功率需注意的几个关键问题