实验六粗糙链孢霉的杂交.docVIP

实验六 粗糙链孢霉的杂交 一、实验原理 粗糙链孢霉(Neurospora crass)属于真菌中的子囊菌纲。它是进行顺序排列的四分体的遗传学分析的好材料。粗糙链孢霉的菌丝体是单倍体(n=7)，每一菌丝细胞中含有几十个细胞核。由菌丝顶端断裂形成分生孢子。分生孢子有两种，小型分生孢子中含有一个核，大型分生孢子中含有几个核。分生孢子萌发成菌丝，可再生成分生孢子，周而复始，这是粗糙链孢霉的无性生殖过程。 粗糙链孢霉的菌株有两种不同的接合型(mating type)，用A、a或mt+、mt-表示，它们受一对等位基因控制。不同接合型菌株的细胞接合产生有性孢子，这过程称为有性生殖。有性生可以通过两种方式进行： 1．当菌丝在有性生殖用的杂交培养基上增殖时，就会产生许多原子囊果，内部附有产囊体，若另一接合型的分生孢子落在这原子囊果的受精丝上时，分生孢子的细胞核进入受精丝，到达原子囊果的??囊体中，形成接合型基因的异核体。进入产囊体中的分生孢子的核发生分裂，并进入产囊菌丝中，被隔膜分成一对细胞形成钩状细胞，亦称原子囊。钩状细胞顶端细胞的二个核形成合子，合子核再进行减数分裂，成为四个单倍体的核，就是四分体，再进行一次有丝分裂，变成八个核，顺序地排列在一个子囊中。原子囊果在受精后增大变黑，成熟为子囊果。一个子囊果叶集中着三十到四十个子囊，成熟的子囊孢子呈橄榄球状，长30-40微米，比3-5微米的分生孢子要大得多。子囊孢子如经60℃处理30-60分钟，便会发芽，长出菌丝，再度开始无性繁殖（图10-1）。 图6-1 链孢霉生活史 2．不同接合型的菌标的菌丝连接，两种接合型的细胞核发生融合形成合子，产生子囊果。粗糙链孢霉的子囊孢子是单倍体细胞，由它发芽长成的菌丝体也是单倍体。所以一对等位基因决定的性状在杂交子代中就能分离。在粗糙链孢霉中；一次减数分裂产物包含在一个子囊中，所以很容易看到一次减数分裂所产生的四分体中一对基因的分离，这就直观地证明基因的分离，并证明基因在染色体上。同时由于8个子囊孢子顺序地排列在子囊中，这就可以测定着丝粒距离并发现基因转变(gene conversion)。若两个亲代菌株有某一遗传性状的差异，那么杂交所形成的每一子囊，必定有4个子囊孢子属于一种类型，4个子囊孢子属于另一类型，它们的分离比倒是1：1，而且子囊孢子按一定顺序排列。如果这一对等位基因与予囊孢子的颜色或形状有关，那么在显微镜下可以直接观察到子囊孢子的不同排列方式。 本实验用赖氨酸缺陷型（记作Lys-）与野生型（记作Lys+）杂交，得到的子囊孢子分离为4个黑的（+），4个灰的（－）。黑的孢子是野生型的，赖氨酸缺陷型孢子成熟迟，所以呈灰色。根据黑色孢子和灰色孢子在子囊中的排列顺序，可有6种子囊类型。 （1）++++－－－－ 第一次分裂分离子囊 （2）－－－－++++ （3）++－－++－－ 第二次分裂分离子囊 （4）－－++－－++ （5）++－－－－++ （6）－－++++－－ 子囊型（1）和（2）的产生如图10-2。第一次减数分裂（M1）时，带有Lys+的两条染色单体移向一致，而带有Lys-的两条染色单体移向另一极。Lys+/ Lys-这对基因在第一次减数分裂时分离，称第一次分裂分离（first division segregration）。第二次减数分裂（M2）时，每一染色单体相互分开，形成四分体，顺序是++－－或－－++，再经过一次有丝分裂，成为（1）和（2）子囊型。形成这两种子囊型时，在着丝粒和基因对Lys+/ Lys-间未发生过交换，是第一次分裂分离子囊。 图6-2 第一次分裂分离 图10-3表示子囊型（3）和（4）的形成。由于Lys基因与着丝粒间发生了一个交换，Lys+/ Lys-在第 图6-3 第二次分裂分离(一) 一次减数分离时没有分离，到第二次减数分裂（M2）时，带有Lys+的染色单体才和带有Lys-的染色单体相互分开，所以称为第二次分裂分离（second division segregration）。然后再经一次有丝分裂，形成4个孢子对，顺序是++－－++－－或－－++－－++。这是第二次分裂分离子囊。 （5）和（6）子囊型的形成与（3）和（4）类似，也是两个染色单体发生了交换，不过交换不是发生在第2条染色单体与第3条染色单体之间，而是发生1，3或2，4两条染色单体之间（图10-4）。 图6-4 第二次分裂分离(二) 从上面的分析可知，第二次分裂分离子囊的出现，是由于有关的基因和着丝粒之间发生了一次交换的结果。第二次分裂子囊愈多，则有关基