2012生化實驗.ppt

2012生化实验;实验安排;胰酶提取; 第一天 新鲜猪胰脏1个 冰浴下剥除脂肪和结缔组织 粉碎胰脏 加100ml巳预冷却的pH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取 检查提取液中PH，若高于pH3.0时应及时用10％乙酸调节，使提取液维持在PH2.5-3.0之间 在冷室5℃左右搅拌提取18—24h ;第2天 4层纱布过滤，取滤液 50m1pH2.5乙酸酸化水抽提残渣一次(时间约为1一2h) 合并滤液，用乙酸溶液调正pH至2.5-3.0 放置3—5h后，，取上清，量其总体积 盐析：加固体粉状硫酸铵，至40％饱和度 盐析1hr 12000rpm 离心 10min 上清液加硫酸铵，至75％饱和度 盐析1hr 12000rpm 离心 10min 沉淀 溶于10ml pH7.5, 0.1 MTris 透析过夜，4 ℃保存;卵清蛋白分离提取;第一天 新鲜鸡蛋两只 取蛋清50 ml 温水浴25℃～30℃ 加入等体积的三氯乙酸－丙酮（1:2V/V） 最终pH约3.5 再继续搅拌30 min 4℃放置过夜 ;第二天 布氏漏斗抽滤（或离心），得黄绿色清液 加入4℃预冷的丙酮200 ml 在4℃放置2 h之后， 弃上部丙酮液，下部沉淀部分于10000 rpm离心5 min 收集沉淀 沉淀溶于10 ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4 h，换水两次 再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜;亲和层析柱材制备;Sephadex-G75的活化及偶联 2.5g干重的葡聚糖凝胶Sephadex G一75，溶胀洗涤数次 加入0.05M Nal04溶液50ml，30Min， 蒸馏水洗涤数次，抽干备用 纯化的鸡卵粘蛋白35ml，加入活化葡聚糖凝胶 5％K2C03、调pH7.5—9.0，缓慢搅拌3h， 随时用5％K2CO3保持pH的稳定 0.27gKBH4溶于20ml水，缓慢搅拌加入上述体系，反应5h，pH维持在6.5—7.5 洗涤;基因组DNA提取;高温裂解（抑制DNase，促进其它分子变性，促溶）； 试剂：NaCl, SDS, EDTA, Tris-HCl pH7.5； 试验材料： 微生物菌体； ; 培养好的菌液1.5 mL， 离心收集菌体 600ul 65℃ 预热的细胞裂解液，悬浮菌体 加入60ul 酚滚动混匀，65℃，30min 加入600ul氯仿混匀，静置4～5min，离心 取上清;质粒DNA提取;;试剂 １：Solution Ⅰ 50mM 葡萄糖, 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 10mM EDTA(pH 8.0), 高压灭菌， 4℃保存 ２：Solution II 0.2M NaOH, 1% SDS, 现配现用 ３：Solution III 5M KAC 60ml,11.5冰乙酸， 28.5水， 4℃保存 ;含氨卞（100ug/ml）的LB培养基 培养菌体 37℃ 200rpm 过夜 吸取1.5ml, 5000rpm,1－2min离心，取沉淀 预冷的100ul Solution Ⅰ,充分振荡悬浮 加入200ulSolutionII,颠倒徭匀后冰浴中3-5min, 150ul预冷Solution III混匀, 冰浴5min 离心,12000rpm,,5min 取上清加等体积氯仿，静置2-4min， 12000g 离心2-4min;PPO提取、纯化;材料 马铃薯（大约每小组100-200g）;粗酶提取 ;纯化I-盐析分级沉淀 ;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;纯化II-分子筛凝胶层析;纯化II-分子筛凝胶层析;纯化III-离子交换层析;纯化III-离子交换层析;蛋白质浓度测定（酶标板）;感受态细胞制备; 感受态机理假说： ①局部原生质体化假说——细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进入细胞。 ②酶受体假说——感受态细胞表面形成一种能接受DNA的酶切位点，使DNA分子能进入细胞。 实验证据 ①发芽的芽孢杆菌容易转化； ②E. coli 的原生质体不能被噬菌感染，却能受噬菌体DNA转化； ③λdg不能转化，但完整的λDNA可以转化，这可能是λDNA能产生溶解细胞壁的酶； ④适量的溶菌酶