分子生物学技术7课件.pptVIP

常用实验基本技术;四大常用基本技术;RNA制备;步骤;逆转录反应（cDNA合成）;逆转录反应体系的基本成分;在逆转录酶的作用下，总RNA中的mRNA在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA（cDNA）； 利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段 ;Oligo dT ：适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。 随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。 基因特异性引物： 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。 ;cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。　　;避免RNA酶污染;PCR;三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配