分子生物学方法和答辩.ppt

分子生物学研究方法和技术;本人基本情况;;;1970年，分离出第一个限制性内切酶（W Arber（瑞士），1978年获诺贝尔医学奖） 1970年，Baltimore和Temin发现了逆转录酶 ——长期的基础研究积累迎来了突飞猛进的高潮。 1973年，Cohen把质粒作为基因工程的载体使用 ——基础研究向应用研究的拓展。 （以上被称为生物工程技术的的三大发明）;3个事例： （1）1976年，重组DNA成功（H Boyer和S N Colen，1981年获诺贝尔化学奖）——勇敢的科学精神。 （2）1982年，美国一制药公司在2000升发酵液中提取出100克精制胰岛素。相当于从1600磅动物胰腺中的提取量——效率、成本、质量、竞争。 （3）荷兰最早把分子生物学产品“猪牛痢疾疫苗”投放市场，比以上美国的胰岛素早半年——后来居上。;人类对生命现象的认识;数、理、化相关学科;分子生物学;2 分 子 生物 学 的 概 念;2.1 分子生物学的定义 ;分子生物学与生物化学之间的关系与区别;★ 构成生物大分子的单体是相同的;结 构 生 物 学;2.4 分子生物学发展的三大支撑学科;1839-1847年 Matthias Schleiden Theodor Schwann;Gregor Mendel 1864 年 ;Biochemistry;3 21 世 纪 分 子 生 物 学 展 望;3.1 自然科学历史舞台 角色将发生重大变化;3.2 未来生物学形成的新热点及领域;生物大分子的高级三维结构与功能的统一 ;个体;计算机语言 ;3.3 应用生物学发展 ;3.4 21世纪—— 生命科学的世纪 ;二十一世纪 生命科学的世纪;分子生物学理论的突破;更加深刻 更为明确 ;第一章 RNA的分离纯化;主要内容; 核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。;一、核酸分离、纯化原则;（二）防止核酸的生物降解;1. DNA酶抑制剂;2. RNA酶（RNAase)抑制剂; (2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意： 1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。 2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。 4）剧毒。;（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC);二 分离提取核酸的主要步骤;（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。; 常用方法： 1. 加入浓盐溶液（如NaCl） 核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚； 2. 加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能； ; 3 . 酚/氯仿抽提 酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯仿：异戊醇=25：24：1）。; 1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。;（三）核酸的沉淀;1. 核酸沉淀的盐类及浓度;2. 有机沉淀剂;（2）异丙醇;（3）聚乙二醇（PEG）;（4）精胺;3. 核酸沉淀的温度和时间;(四）核酸的浓度测定; 紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤;A：测DNA： 纯的DNA样品OD26