微生物實驗手册.docVIP

PAGE \* MERGEFORMAT39 微生物实验室规则与安全 微生物学实验室规则 医学微生物学实验的对象大多为病原微生物，具有传染性，因此要求进入实验室后必须严格遵守以下实验室规则： 1．进入实验室应穿白大衣，离室时脱下，反折放回原处，不必要的物品不得带入实验室，必须带入的书籍和文具等应放在指定的非操作区，以免受到污染。无菌操作时必须戴口罩，并不得开电风扇。 2．实验室内禁止饮食、抽烟，不得高声谈笑或随便走动。 3．各种实验物品应按指定地点存放，用过的器材必须放入消毒缸内，禁止随意放于桌上及冲入水槽。 4．须送温箱培养的物品，应做好标记后送到指定地点。 5．实验过程中发生差错或意外事故时，禁止隐瞒或自作主张不按规定处理，应立即报告老师进行正确的处理。如有传染性的材料污染桌面、地面等，应立即用0.2%~0.5% “84”消毒液浸泡污染部位，作用5～10min后方可抹去。如手被活菌污染也应使用上述消毒液浸泡5～10min后，再以自来水反复冲洗干净。 6．爱护室内仪器设备，严格按操作规则使用。节约使用实验材料，不慎损坏了器材等，应主动报告老师进行处理。 7实验完毕，应物归原处并将桌面整理清洁，实验室打扫干净。最后以0.2%~0. 5% “84”消毒液浸泡手5min，洗净后方可离开实验室。 实验一 器皿包扎及消毒与灭菌 一、实验目的 1、了解玻璃器皿的清洗、棉塞制作、移液管和培养皿的包扎方法。 2、了解干热灭菌、紫外线灭菌、微孔滤膜过滤除菌和高压蒸汽灭菌的原理和应用范围。 3、掌握高压蒸汽灭菌的操作技术。 二、实验原理 （1）实验室中使用的玻璃器皿简介 微生物学实验所用的玻璃器皿，大多要进行消毒、灭菌和（将“和”改为“才能”）用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。玻璃器皿的质量一般要求硬质玻璃，才能承受高温和短暂灼烧而不致破坏；玻璃器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的形状和包装方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤玻璃器皿的方法不当也会影响实验的结果。目前微生物学实验室中，有些玻璃器皿（如培养皿、吸管等）已被一次性塑料制品所代替，但玻璃器皿仍是重要的实验室用具。 （2）灭菌的常用方法和基本原理 实验室常用的灭菌方法有干热灭菌法、紫外线照射法、微孔滤膜过滤除菌法和高压蒸汽灭菌法等。 A.干热灭菌是用电热干燥箱（图1）加热，利用高温使微生物细胞内的酶、蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 B.紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。 C.微孔过滤除菌（图2、图3）是通过机械作用滤去液体或气体中细菌、真菌孢子等的方法。 D.高压蒸汽灭菌也是使蛋白质变性而灭菌，高压蒸汽灭菌锅（图4、图5、图6）灭菌时是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 图1 电热干燥箱的外观和结构 图2 图3 图4 高压蒸汽灭菌锅 图5 卧式灭菌锅 图6 手提式灭菌锅 1.安全阀；2.压力表；3.放气阀；4.软管；5.紧固螺栓；6.灭菌桶；7.筛架；8.水 干热灭菌与高压蒸汽灭菌的灭菌效果与所灭物品的蛋白质含水量有很大的关系（表1）。就效果而言，湿热灭菌效果要比干热灭菌效果好（表2）。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要（表3），因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 表1 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系 卵白蛋白含水量/%30分钟内凝固所需温度/℃50562574-801880-906145 表2 干热、湿热穿透力及灭菌效果比较 温度/℃时间/h透过布层的温度/℃灭菌10层20层100层干热130-1404867270.5不完全湿热105.33101101101完全 表3 灭菌锅内留有不同分量空气时压力与温度的关系 压 力 数 全部空气排出时的温度 (℃) 2/3空气排出时的温度 (℃) l/2空气排出时的温度 (℃) 1/3空气排出时的温度 (℃) 空气全不排出时的温度 (℃) MPa kg/cm2 1b/in2 0.03 0.07 0.10 0.14 0.17 0.21 0.35 0.70 1.0