实验设计-外显子的捕捉与鉴定技术总结.docxVIP

外显子的捕捉与鉴定 实验目的 通过本实验了解外显子捕捉的实验原理，掌握外显子捕捉和采用DNA探针检测特定DNA片段的遗传分析方法。 实验原理 真核生物的基因结构 不同于原核生物，真核生物基因的编码序列是不连贯的，即在两个编码序列之间有一段不编码蛋白质的非编码序列。编码序列称为外显子（exon），非编码序列称为内含子（intron）。两个外显子之间插入了一个内含子。外显子是出现在mRNA分子中的基因序列；内含子则是不出现在mRNA分子中的基因序列。 外显子捕捉 “外显子捕捉( exon trapping ) ”曾称exon amplification, 是从基因组克隆片段中分离可表达序列的技术之一，在“人类基因组计划”中得到了广泛的应用，是通过构建一种载体，从其插入片段中识别和回收外显子序列的实验方法。 捕捉外显子的载体pETV-SD是一种反转录病毒穿梭载体（shuttle vector），即其可在不同种的生物中如大肠杆???和酵母中，细菌和哺乳动物细胞中进行复制的载体。 因为凡是含有内含子和外显子的基因在转录后都要经过RNA剪接，这就需要有剪接供体（splicing donor，SD）位点和剪接受体（splicing acceptor，SA）位点。因此，SA位点可作为基因的标志。pETV-SD载体的片段中含有无SA的位点。它含有β珠蛋白(HBG)基因的第1个外显子、其有功能的SD位点、该基因的间隔序列（IVS）和α，β-半乳糖苷酶（α，β-GAL）基因。 原位杂交（in situ hybridization）定位 原位杂交是将待定基因的特定DNA序列或该基因转录产生的RNA分子作为探针，在标记了放射性同位素或非放射性化学物质后与变性后的染色体DNA杂交，该探针就会同染色体DNA中与其互补的序列结合成为双链，通过放射自显影技术或显色技术，就可显示标记了放射性同位素或非放射性化学物质的探针的位置，达到基因定位的目的。 用放射性化学物质如荧光素标记探针后，则在荧光显微镜下，探针所在的位置上可呈现出荧光，这称为荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）。 操作步骤及基本原理如下： 提取细胞核中的基因组DNA； 特定的限制性内切酶切割真核基因组DNA，获得所要检测的DNA小片段； 将获得的DNA小片段克隆在位于“外显子捕捉序列”下游的克隆位点上； 将获得的重组载体感染反转录病毒的专宿包装细胞系（ecotropic retroviral packaging cell line）——ψ2细胞系。ψ2细胞提供蛋白质产物使载体（自身不能合成病毒蛋白质）成为反转录病毒在细胞里增殖。当反转录病毒在细胞内转录时，插入的DNA片段中包含有功能的SA位点，会发生RNA剪接反应而将IVS切除； ψ2细胞培养液中含有包装了已剪接和未剪接病毒RNA的病毒子（virion），用来感染组成型产生SV40T（肿瘤）抗原的COS细胞。病毒RNA基因组被反转录，并在载体上的SV40复制起点作用下，以环状DNA附加体形式进行复制。 从COS细胞中回收复制的附加体DNA，经限制性内切酶Dpn Ⅰ酶切后转化细菌。在含卡那霉素（Kn）和5-氯-4溴-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）的培养基上挑选转化子。β-半乳糖苷酶可水解X-gal而生成蓝色产物，不产生β-半乳糖苷酶的转化子菌落则呈白色。 只挑选白色菌落作进一步研究的材料。白色菌落的生成可以有两种原因。一是由于基因发生突变，使β-半乳糖苷酶失去活性；二是由于在反转录病毒生活周期的RNA 时期中发生了剪接反应，从而丢失了α，β-半乳糖苷酶基因。 如果是真正发生了RNA剪接事件，准确的剪接反应可切除作为标记的IVS，使人β珠蛋白基因的第1外显子与落入了捕捉陷阱的插入片段中的外显子序列直接连接； 从白色菌落制成的菌液中分离载体，采用可以和该段外显子特定核酸序列互补的DNA探针进行原位杂交，可以鉴别该菌落是否是由捕获了外显子的转化子形成的。 实验材料 毕赤酵母菌、pETV-SD载体、限制性内切酶A、DNA连接酶、ψ2细胞系、组成型产生SV40T（肿瘤）抗原COS细胞系、限制性内切酶Dpn Ⅰ酶、大肠杆菌 实验用品和试剂 实验步骤 毕赤酵母基因组DNA的提取 接种重组和空质粒转化子于5ml YPDZ培养基，GS115菌于YPD培养基作对照，30℃培养16～18小时。 室温下，1500 g离心5-10min收集菌体。 100 ul TE（pH 7.0）重悬，加入300 ul EDTA（pH 8.0），0.07M Tris-HCl，3 ulβ-巯基乙醇，1ul Lyticase ，37℃水浴30 min。 10000g离心5~10min，取沉淀，加90ul TE重悬。 2