临床分离MRSA中氨基糖苷类双功能修饰酶AAC（6）′-APH（2″）的克隆表达与活性测定.pdfVIP

第??卷 第 ?期? 上海 师范大学学报 ?自然科学版 ?? ???．??．??．?? ???????年 ?月? ???????????????????????????????????????????????????? ???．，???????? 临床 分 离 ???? 中氨 基 糖 苷 类 双 功 能 修 饰 酶? ???????????????的克 隆表达 与活性测定? 王春霞?，陈俊升?，邵? 雷?，陈代杰?，李继安?? ??．上海师范大学 生命 与环境科 学学院，上海 ??????；?．上海 医药工业研 究院 生物部 ，上海 ???????? 摘 要 ：双功能酶 ???????．?????”?是一种重要的氨基糖苷类抗生素钝化酶，从 临床分 离出? 的?株耐甲氧西林金黄 色葡萄球菌??????的总???中克隆得到 ???????一?????”?基因，将? 该基 因插入质粒 ???????中构建表达载体 ，然后将该重组质粒转入大肠杆菌 ????进行异源表? 达 ，在 ????的诱导下产生大量可溶性 目标重组蛋 白，该重组蛋 白经亲和层析分 离纯化 ，???—? ????鉴定纯度大于??％；建立 了此双功能酶的体外测活方法，为建立氨基糖苷类抗 生素双功? 能 酶抑 制剂 筛选模 型 奠定基 础 ．? 关键词 ：氨基糖苷类抗生素 ；耐 甲氧西林金 葡茵 ；双功能酶；异源表达? 中图分 类号 ：?????? 文献标 识码 ：?? 文章 编 号 ：?????????????????????????? ?? 引? 言? 氨基糖苷类抗生素具有抗菌谱广 、杀菌力强 、与 ?一内酰胺抗生素协同作用好 等特点 ，具有重要的? 临床价值 ，但耐药菌 的出现严重限制了这类抗生素的使用??．其中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 ??????—? ??????????????????????????????????????，?????等耐药菌对氨基糖苷类抗生素耐药的主要原因是 ：大量 出现? 钝化酶修饰现象．酰基转移酶 ??????????????????，????、腺苷转移酶 ????????????????????，????和磷酸转? 移酶????????????????????，????是耐药菌的产生的主要钝化酶??．编码这些钝化酶的耐药基因通常 由质? 粒携带 ，很多又与转座子相连 ，加速 了这些耐药基 因在种 间的传递????．临床分子病理学检验表 明：在 临? 床分离的 ???株 ????中，???????一?????”?的阳性率达 ??％ ，它具有磷酸转移酶和乙酰基转移酶两? 种活性 ，介导了 ????对氨基糖苷类抗生素 的耐药性??．在 已检测出的 ?株具有氨基糖苷类抗 生素耐? 药性的非重复分离 ????中 ，克隆得到 ?????????????”?基因 ，然后构建了该酶的原核表达质粒 ，在大? 肠杆菌 中异源表达 ，纯化重组蛋白并做活性鉴定．? ? 材料和方法? ?．? 材 料? ?．?????????、?．??????????????、???????和枯草芽孢杆菌由本实验室保存 ；????— ?购? 上海生? 工生物工程公司 ；?株非重复分离的 ????由浙江大