细菌的分离、接种及培养.pptVIP

实验五 细菌的分离、接种和培养 ;目的要求 实验原理 实验材料 实验步骤 操作规范示例 作 业;一、目的要求 掌握从环境（土壤、水体、活性污泥等）中分离和纯化 微生物的方法和原理； 倒平板； 细菌纯种分离：稀释混合平板分离法、稀释涂布平板分离法和平板划线法； 接种技术； 无菌操作技术； ; 在自然界中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起的，为了生产和科学研究的需要，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离出它，以得到只含有这一种微生物的纯培养物，这种获得纯培养物的方法称为微生物的分离与纯化。 为了获得纯种的微生物，一般根据该微生物营养或培养特点(微生物对营养、酸碱度、氧等条件)，或对某种抑制剂的耐受性不同，或对某种环境条件要求不同，从而制作或设置一些选择性培养基，或选择性培养条件，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或划线法分离，纯化该微生物，直至得到该纯种菌株。 ;三、实验试剂与器材 土壤样品（环境样品） 牛肉膏蛋白胨培养基； 无菌试管、无菌三角瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿； 超净工作台;（一） 稀释混合平板法;1. 土壤稀释液的制备 ① 称取土样10g，放入盛90ml无菌水三角瓶中，振荡15～20分钟，使微生物细胞分散，静置约20～30秒，即成10-1的土壤悬液。 ② 另取装有9ml无菌水的试管，编号为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，用无菌吸管吸取10-1土壤悬液l ml，加入编号10-2的无菌试管中，吹吸三次，使之混合均匀，即成10-2的土壤稀释液。再用另一支吸管吸取10-2试管中的土壤稀释液1ml，加入编号10-3的无菌试管中，轻轻摇动，使之混合均匀，即成10-3的土壤稀释液，一定要每次更换一支无菌吸管（连续稀释）。同法依次分别稀释成10-4、10-5和10-6等一系列稀释度菌悬液。 ;2. 平板制作 将无菌培养皿编上10-3、10-4、10-5号码，每一号码设三个重复，用1ml无菌吸管按无菌操作要求吸10-5稀释液各1ml，分别放入编号10-5的三个培养皿中。同法吸取10-5稀释液各1ml，分别放入编号10-4的三个培养皿中。再吸取10-3稀释液各1ml，分别放入编号10-3的三个培w1养皿中。然后在9个培养皿中分别倒入15ml已融化并且冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝固后即成平板，整个操作过程应严格按照无菌操作。 ;3. 培养与移植 待平板完全冷凝后，将平板倒置37℃恒温箱中培养24～48小时，检查分离结果。将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到牛肉膏蛋白胨培养基的斜面上，然后置于37℃恒温箱中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其它杂菌混杂，就可再一次进行分离、纯化，直至获得纯培养。;（二）稀释涂布平板法 此法与稀释混合平板法基本相同，无菌操作也一样，所不同的是先将牛肉膏蛋白胨培养基融化，在火焰旁注入培养皿，摇匀后制成平板，然后用三支1ml无菌吸管分别由10-4、10-5、10-6三管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，然后分别倒置于37℃温箱中培养后，再挑取单个菌落，直至获得纯培养。;（三）平板划线分离法;制备土壤稀释液;倾注平板;培养 ; 挑菌落;移接斜面 常用的接种方法 划线接种 点接种 穿刺接种 涂布接种 液体接种 注射接种;斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞 ;纯化（平板划线法） 倒平板——划线——培养——挑菌落——纯种（纯培养） ;平板划线分离的方法 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法;五、微生物实验技术操作规范示例;（一）斜面接种无菌操作技术;(二）倒平板及平板划线接种;（三）平板划线接种：;六、作 业;一、视频演示 二、取自己做的培养皿，观察，并作图 三、挑取菌落，进行革兰氏染色，初步判别革兰氏阴性或阳性菌 四、将自己的培养皿、试管清洗干净，放入抽屉 五、作业：从土壤中分离细菌的主要实验步骤。