浅谈薄层色谱的上样.pptVIP

浅谈薄层色谱的上样;前言; 上样是薄层色谱分析开始操作的第一步，也是最关键的一步。它既关系到能否得到可以重现的分离度好的可鉴别性的薄层色谱，更关系到定量测定结果的准确，因为上样是最主要的误差来源。; （一）如果在上样后和分离前不对原点的样品采取“浓集”处理，在薄层板上样品容积的负荷量是极为有限的，工作范围很窄。如果上样容积过大，将明显降低分离效率。中药供试液中欲测成分与“杂质”成分共存，更限制了样品有效容积负荷量。 ; 我们在做中药薄层鉴别时习惯于加大点样量，固然往往由于供试液中欲测成分的低含量并混有较大量的干扰物质，不得不加大上样容积，另一方面也许是由于对上样溶剂超负荷的严重后果认识不足。 ; 常规薄层板展距100mm，原点直径3mm，展开后如斑点直径扩散到6mm，则斑点容量或称分离数（SN）=10，而用高效薄层板原点直径1mm，展开50mm，斑点直径扩散为2mm，则SN=15。但如果上样不适当，原点也点成直径3mm，展开50mm后扩散为4mm，则SN=6，由此可以看出即使用高质量的薄层材料，如上样溶剂不适当的扩大，同样也会大大降低分辨率，即使延长展距至100mm，SN也仅仅是11，不可能达到15。 ; （二）供试液的溶剂均有不同程度的洗脱力，所以在上样的同时，样品在原点就可以成圆形展开，原点直径的扩散促进了这种展开，Kaiser称之为“上样圆形色谱效应”。如果样品在溶剂中的溶解度很大，原点将变成空心圆。这种效应对随后的先行展开造成很不利的影响。 ; （三）供试液的溶剂在原点的残留，也会改变展开的选择性，特别是供试液的溶剂与展开剂的极性相差较大时更明显。再者，亲水性溶剂残留在原点吸收大气中的水分（特别在高湿度环境）对色谱的影响也不可低估。因此，上样时的同步干燥或继后干燥以除去原点残存的溶剂是需要的。 ; 但应尽可能避免高温加热，如用吹风筒加热，样品变为固态后，部分或全部强烈的吸附在吸附剂的颗粒上，而促进了硅胶的有催化作用的活性表面故态化学反应，导致样品的变性（尤其热不稳定物质），至少移动相在展开时对这部分样品的溶解速度比移动速度慢得多而形成拖尾（斑点拖尾的原因之一）。我们有时发现单一的成分展开后在原点仍有部分滞留不能展开，一个原因可能就是这种催化作用引起。 ; （四）上样装置（毛细管、注射器）对薄层表面的机械损伤对定量分析将会带来灾难性后果。特别是已载有样品的表面颗粒被划伤刮除就更严重。一个壁厚0.02mm外径0.3mm的注射针头在薄层表面施加5g的机械力，表面局部承受的压力是30巴。 上述这些值得重视的问题对薄层色谱来说不是不可克服的。 ; 因为有多种上样技术和上样后的“修复”步骤，使平面色谱的上样问题比柱色谱更少（柱色谱分离是在样品供试液的溶剂共存的情况下进行的，所以样品在上样的容积中的分布对最终的分离效率肯定有影响，而平面色谱不存在这一问题）。因为平面色谱是靠展开而不是靠洗脱来分离的，其次，平面色谱是由吸附、溶剂、溶剂蒸气参与的三维展开过程，不同于柱色谱的一维展开，上样更具有灵活性。 ; 上样最常用的方法是用毛细管或注射器靠毛细作用接触薄层板面，即点样。 上样最常用的方法是用毛细管或注射器靠毛细作用接触薄层板面，即点样。上样工具很重要，用管状点样器械上样很容易带来误差：薄层表面的损伤、“爬壁”效应造成的外壁样品的沉积、样品的记忆效应等，此外还有管中的微小气泡。 。 ; 目前，瑞士CAMAG厂的Nanomat点样器配合定量毛细管上样可以等距离间隔定位，并可避免手持毛细管点样时的用力不匀，它靠机械控制接触板面，压力是恒定的，点样误差可以1%，这是一种相对来说价格比较便宜质量优良的上样器械，最近生产的Nanomat-III型可以用于手制板。自动点样器（如CAMAG的Auto Sampler - II）不仅可以精确地定位（±0.05mm），精确地上样（1%），而且可以把操作者的双手解放出来，不过这种精密仪器价格昂贵。; 误差不可能完全消除，但是尽量减小误差是可以做到的。薄层色谱上样较之GC，HPLC更容易产生系统误差，且误差的大小与样品的溶解度、溶液的表面张力、溶剂的捻度，挥发性和极性、上样耗费的时间、薄层板的质量（颗粒大小，板厚度，粘合剂种类，可湿性）等多种因素有关。但是这决不意味着定量测定结果的准确性和重复性一定差，一个明显的例子是1987年由西德W.Funk教授主持的7个国家的16个实验室参加的胆固醇高效薄层色谱定量测定所取得的与HPLC相比毫不逊色的结果 。 ; 提高上样技术是获得质量良好的薄层色谱的关键之一。对于简单的样