前列腺素脱氢酶对大肠癌SW480细胞恶性增殖的抑制作用的论文.docVIP

　　前列腺素脱氢酶对大肠癌SW480细胞恶性增殖的抑制作用的论文 【摘要】 目的 研究15羟基前列腺素脱氢酶(15hydroxyprostaglandin dehydrogenase, pgdh)对stt法、平板集落和软琼脂克隆形成实验，分析pgdh对srna及蛋白在大肠粘膜及多种正常组织中表达，但在大肠癌组织中表达下调[2,3] ; 肺腺癌a549细胞转染表达pgdh后,裸鼠致肿瘤能力明显降低[4]；转染pgdh能够诱导乳腺癌细胞凋亡[5]等。大肠癌中pgdh的抑癌作用及可能的机制国内尚无报道，对pgdh的进一步研究不仅对探索肿瘤发生发展的分子生物学机制具有重要意义,并能够为肿瘤的诊断和治疗提供实验及理论的积累。 1 材料和方法 1.1 主要试剂 trizol、rpmi1640、lipofectamintm购自invitrogen公司；mtt、细胞用琼脂粉购自sigma公司；限制性内切酶、反转录pcr试剂盒购自takara公司；大肠癌细胞株san公司；p53、p21单克隆抗体及hrp标记二抗购自santa cruz公司；ecl检测试剂购自amersham公司；其他均为国产分析纯试剂。 1.2 方法 1.2.1 重组质粒的构建 利用trizol提取正常人大肠粘膜组织总rna，通过反转录pcr扩增pgdh编码框。合成5′端含hind ⅲ (上游)和bamh ⅰ(下游)酶切位点的引物( f1：5′aag ctt ctg cac cat gca cgt ga 3′；f2：5′gcg gat cct tca gct atg gct aac3′）。再将载体pcdna3.1和pgdh的pcr产物分别于37℃，bamh ⅰ和hind ⅲ酶切,回收产物经t4连接酶16℃连接20h，然后转化感受态dh5α，阳性克隆命名为pcdna3.1pgdh，经pcr、双酶切和测序验证。 1.2.2 细胞培养和基因转染 sl青霉素和100u/ml链霉素的rpmi1640培养基中。收获对数生长期的细胞(细胞数约5×106)接种于60mm培养皿，待细胞密度长至90%时，参照lipofectamintm2000试剂操作指南分别用pcdna3.1pgdh和pcdna3.1质粒转染细胞，获得sl细胞浓度接种于96 孔板，置培养箱，24小时后每孔加20μl mtt (5mg/ml)，4小时后加入二甲基五枫100μl，室温振荡10min，应用酶联免疫测定仪，测波长490nm吸光度值，每天计数，每组细胞10孔，连续检测6天，绘制细胞生长曲线。 1.2.4 细胞平板集落形成实验 取转染24小时后的细胞200个接种于6孔板。5%co2、37℃、饱和湿度条件下培养14天，可见细胞集落时终止培养。常规pbs漂洗，甲醇固定10min，0.4%结晶紫染色10min。实验重复3次,显微镜下计数大于50个细胞的集落数,取平均值。集落形成率=集落数/接种细胞数×100%。 1.2.5 软琼脂集落形成实验 将0.7%琼脂糖和1.2%的琼脂粉灭菌处理后，当温度降至40℃时，按1∶1比例与2×rpmi1640 (含双倍血清和抗生素)混合成为上层和下层培基，加1.5ml下层培养基于6孔板凝固后，将约2 000个细胞与1.5ml上层培养基混合,加到已凝固的底层琼脂上。5%co2、37℃、饱和湿度条件下培养20天，于倒置显微镜下观察。实验重复3次，镜下(×40)随机挑选10个视野计数细胞克隆数。 1.2.6 流式细胞仪检测 1×105个/ml的细胞悬液，用pbs洗涤2次，700ml/l冷乙醇固定，dapi染色，上样于流式细胞仪进行细胞周期检测，计算各周期百分比。 1.2.7 in，4℃、12 000g离心10min，收集上清，用bradford法定量。取50μg样品与等体积的2×上样缓冲液混匀，100℃煮沸5min，12% sds聚丙烯酰胺凝胶(page)分离蛋白。半干式电转移至硝酸纤维素膜，5%的脱脂奶粉室温封闭2h，加入封闭液1∶1 000稀释的pgdh、p53、p21及βactin多抗，4℃过夜；pbst洗3次，每次5min；加hrp标记的二抗，室温反应2h，pbst洗3次，每次5min；ecl发光，x线胶片曝光。 1.3 统计学方法 采用spss11.0统计软件对计量资料进行student′s t检验分析，计数资料进行χ2检验。plt;0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 pcdna3.1pgdh真核表达质粒的构建和鉴定 采用基因重组技术构建了pcdna3.1pgdh质粒, pcr及酶切后送菌液测序,正确的质粒用于下一步实验，见图1。 2.2 pgdh基因对syc扩增，p53和apc突变等[7，8]，这些基因仍不足以解释肿瘤的发