RAPD实验方案.doc

PAGE  PAGE 8 DNA分子标记技术在物种鉴定和系统分析中的应用 ——草坪草的RAPD分子标记 一、溶液配制及物品准备 所有水均使用超纯水116室，如果没有则用去离子水。 配制1 M Tris-HCl (pH8.0) 【100mL】-蓝盖瓶装 配方: 1 M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0) 1. 称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中。 2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。 PH值 浓HCl 7.4 约70ml 7.6 约60ml 8.0 约42ml 4. 将溶液定容至1 L。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 配EDTA（0.5 mol/l pH8.0）【500mL】-蓝盖瓶装 配方: EDTA（0.5 mol/l pH8.0） (1)称取93.06克EDTA·2Na·2H2O，置于500 mL烧杯中 (2)加入约400 mL dd H2O.用热磁力搅拌器充分搅拌 (3)用NaOH调节pH值到8，约用10克固体NaOH (4)在溶液冷却后，再用NaOH调节至pH=8 (5)加dd H2O将溶液定容到500 ml (6)高温高压灭菌后，室温保存 EDTA二钠盐难溶，需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0时才会溶解。配制时，可以直接将EDTA·2Na·2H2O和约10g的NaOH （注意约10g，不要一次加到10g，为后面pH微调留下余地）一起加水混合，充分溶解，再微调pH。 1×TE Buffer 储存液【1L】-烧杯配制，锥形瓶分装 分装至500mL锥形瓶中，250mL/瓶，分成4瓶。灭菌备用。 配方 组份浓度 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA（pH8.0） 1. 量取下列溶液，置于1L烧杯中。 1 M Tris-HCl Buffer（pH8.0） 10mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 2mL 2. 向烧杯中加入约800mL的去离子水，均匀混合。 3. 将溶液定容至1L。 4. 高温高压灭菌，室温保存。 将1-3的溶液配好后，再统一灭菌，保存。 准备灭菌水（500 mL蓝盖瓶装）1瓶，黄枪头，蓝枪头，白枪头，进口1.5 mL离心管2盒，普通1.5 mL离心管2盒，普通4 mL离心管2盒，PCR小指管200 μl 2盒，灭菌，保存。 每次实验完毕后，各小组将灭菌水1瓶，黄枪头，蓝枪头，白枪头，进口1.5 mL离心管2盒，PCR小指管200 μl 2盒，重新装满，灭菌后，放在120南面的实验架上。 电泳缓冲液：【随用随配】 5×TBE（贮存液/L室温保存）【500mL】 54 g Tris碱 27.5 g硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA（pH 8.0） 0.5×TBE（工作液） 注意：实验用药品在天平上方的架子上，其他需要4℃保存的药品等，放置在120室透明门冰箱最底层。需要-20 ℃保存的药品，染料，引物等在119室1号冰箱下层冷冻室的第一个抽屉中。配好的试剂，如需要存放，写好标签，放在对应冰箱中。用后归位！ 二、草坪草基因组DNA的提取 草坪草提前两至三周种植，当草坪草的生长到了比较茂盛的阶段，即可进行基因组DNA的提取。使用天根新型植物基因组提取试剂盒(DP320)，操作步骤如下： 处理材料：清洗研钵及研磨棒，晾干或烘干，液氮预冷。取草坪草新鲜叶子组织100 mg 加入液氮充分研磨。加入400 μl缓冲液LP1和6 μl RNase A（10 mg/ml），漩涡震荡1 min，室温放置10 min。 要求：每一大组4种植物，每种提取4份，共16小管。同一种植物可以取1g-1.5g一次研磨，再分成4份，分别处理。 加入130 μl缓冲液LP2，充分混匀，漩涡震荡1 min。 12000 rpm（~13400 g）离心5min，将上清移至新的离心管中。 加入1.5倍体积的缓冲液LP3（使用前检查是否已加入无水乙醇），立即充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀。 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm（~13400 g）离心30 s，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。 向吸附柱CB3中加入700 μl漂洗液PW（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm（~13400 g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 注意：如果吸附柱呈现绿色，向吸附柱CB中加入500 μl无水乙醇，1