2013 CRISPR-Cas9介导的基因组定点编辑技术.pdfVIP

CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术 * 方 锐 畅 飞 孙照霖 李 宁 孟庆勇 ** (中国农业大学农业生物技术国家重点，北京 100193) 摘要 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9系统成功被改造为第三代人 工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)一样可用于各种复杂基因组的编辑．目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌的 基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点 InDel突变、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失．由于其突变效率 高、制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具．本文从 CRISPR/Cas的研究历 史、分类、作用机理以及基因定点修饰应用等方面进行简单介绍，希望能够为在这一领域的科研工作者提供参考． 关键词 人工核酸内切酶，基因编辑，CRISPR，基因打靶，CRISPR/Cas 学科分类号 Q7 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2013.00215 生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biophysics 2013, 40(8): 691~702 *现代农业产业技术体系建设专项资助项目 (CARS-37). **通讯联系人. Tel: 010 E-mail: qingyong.meng@ 收稿日期：2013-05-19，接受日期：2013-07-29 基因定点修饰是研究基因功能的重要手段之 一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类 技术成为现代分子生物学的研究热点．早期仅基于 同源重组的基因打靶技术效率极低，应用受到限 制．直到人工核酸内切酶(engineered endonuclease， EEN)出现，将这一现状彻底改变． 锌指核酸内切酶 (zinc finger endonuclease， ZFN)是第一代人工核酸内切酶．锌指是一类能够 结合 DNA的蛋白质，人类细胞的转录因子中大约 有一半含有锌指结构，ZFN是将锌指蛋白与核酸 内切酶 Fok玉融合形成的核酸内切酶[1]，利用它可 以在各种复杂基因组的特定位置制造 DNA的双链 切口． 到目前为止，ZFN已经成功应用于黑长尾 猴、大鼠、小鼠、中国仓鼠、斑马鱼、果蝇、海 胆、家蚕、拟南芥、烟草、玉米、猪、牛、人类 iPS细胞[2]．更令人振奋的是已经有用于治疗 HIV 的 ZFN(破坏人 CCR 基因表达)药物进入二期临床 试验[3]．但是，ZFN制备复杂，成本昂贵，而且其 技术专利被少数几家商业公司控制．很快，第二代 人工核酸酶——类转录激活因子效应物核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease， TALEN)的出现在很大程度上替代了 ZFN．2009 年，科学家将一种水稻的致病菌(Xanthamonas)编码 的类转录激活因子效应物(transcription activator-like effector，TALE)与 DNA的碱基对应关系解密[4-6]． 2010年，首次报道 TALEN 蛋白在酵母中应用成 功[7]，之后，在植物、人类细胞、小鼠、斑马鱼、 猪、牛中得到迅速的应用 [8]．TALEN 可以和 ZFN 一样对复杂的基因组进行精细的修饰，同时其构建 较为简单，特异性更高，因此受到了科研工作者的 青睐．2012年，TALEN被《科学》(Science)杂志评 为十大科学突破之一[9]．无论是 ZFN还是 TALEN， 这两种人工核酸酶的原理是一样的，都是由 DNA 结合蛋白与核酸内切酶 Fok玉融合而成． 2013年 初，一种全新的人工核酸内切酶 clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR-associated(Cas)9出现，它主要是基于细菌 的一种获得性免疫系统改造而成，其特点是制作简 单、成本低、作用高效[10]．本文主要从 CRISPR研 究历史、作用机理以及 CRISPR/Cas在定点修饰中 的应用等方面介绍 CRISPR/Cas9的研究进展． 生物化学与生物物理进展 Prog. Biochem. Biophys. 2013; 40 (8) 2 CRISPR研究历史 1987年，日本课题组在 K12