分子生物学技术3课件2.ppt

分子生物学实验技术;一、DNA序列测定-研究DNA一级结构; Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。2ˊ,3ˊ-ddNTP脱氧核糖的3ˊ位缺少羟基，它可以与多核苷酸链的3ˊ羟基形成磷酸二酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致多核苷酸链的延伸终止。如果在DNA的合成反应中，加入一种少量的ddNTP，则多核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列长短不一的核苷酸链。在每组独立的DNA合成反应中，分别加入1种ddNTP，结果生成的4组核苷酸链将分别终止于各个A，G，C，T的位置上。对这4组核苷酸链进行高分辨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（高压电泳），就可读出序列。 ;（构成DNA）;O;;;DNA链末端合成终止法;G;3、DNA自动测序;*DNA自动测序仪;;ddG;* 自动测序仪测序法原理 　　自动测序仪测序是在双脱氧末端终止法测序技术的基础上建立起来的。其基本原理是，在4个双脱氧核糖核苷三磷酸分子上各自共价连接一个能发出特定荧光的荧光染料分子，这样，当某一个特定的ddNTP-荧光染料分子掺入到正在延伸的DNA单链分子中就终止了此DNA单链分子的延伸并标记上了特定的荧光染料分子。所以，自动测序仪的测序反应可在一个反应体系中一步完成。然后将这些标记了特定荧光染料分子的，只差一个碱基的不同长度的寡聚核苷酸单链片段上样于同一个变性聚丙烯酰胺凝