分子生物学技术6课件2.ppt

分 子 生 物 学 技 术;第二节 PCR;PCR技术原理;反应过程： 变性：升高温度使模板DNA变性、双链分开； 退火：再降低温度使引物与模板DNA配对互补结合； 延伸：然后升温到聚合酶反应适宜的温度，此时在聚合酶催化下，从引物3’羟基端开始，与模板DNA上的碱基配对逐个加上核苷酸，合成新的DNA链。 循环：其后再按高温变性、低温退火、适温合成三步反复循环，新合成的DNA在下一循环中又作为模板使用，每循环一次，合成的目的序列扩增一倍 ;PCR反应条件的优化： 引物设计: 长度18-24bp 避免3端的互补, 否则容易造成DIMER 避免内部形成二级结构 ;;退火温度： 熔解温度（Tm）是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度； 合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃； ;镁离子浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带;循环次数：当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA 浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加 ;Hotstart PCR（热启动PCR） 热启动主要是通过抑制PCR反应体系一种基本成分，延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。避免了起始循环较低温