凝胶电泳-PPT教程.pptVIP

凝胶电泳分离纯化的原理及应用;一、背景知识介绍 二、凝胶电泳具体实验操作 三、应用;一、背景知识介绍; 自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。 凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。;电泳的基本原理： 在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积，即F＝QE。质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F′＝6πrην式中r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：F＝F′即QE＝6πrην 球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。;电泳迁移率（m, electrophoretic mobility ）是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度 迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。; DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 为了获得好的电泳结果，应尽量减少电荷效应，增加分子筛效应。;常用的凝胶电泳有两类 ： 琼脂糖凝胶电泳：分辨率稍低，适于较大分子 。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨率高，适于较小分子。 ;凝胶电泳的检测灵敏度 与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的检测灵敏度在0.2～50Kb之间; 聚丙烯酰胺的检测灵敏度在1～1000bp之间 ;琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在 碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙 锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。;不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离,如下表所示: ;核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA(covalently closed circular，简称cccDNA)＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA(一般为球形)不能进入胶中，相对迁移率为0(Rm=O)，而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以 长轴方向前进(Rm＞O)，由此可见，这3种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。 ;琼脂糖凝胶电泳优点 （ 1 ）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占 98 %～ 99 %），近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸收吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。（ 2 ）琼脂糖呈透明状，无紫外吸收，电泳后的样品可直接用紫外检测；电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。（ 3 ）操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳; 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1kb的DNA片段和DNA序列分析。其装载的样品量大，回收DNA纯度高。长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸 分子即能分离。 ;聚丙烯胺凝胶电泳优点： （1）分辨率高； （2）载样量大； 1cm?1mm的加样孔加入10 ? g 分辨率不下降，而琼脂糖0.5cm ? 1mm加样孔加入100-500ng的DNA分辨率下降。 （3）回收DNA纯度高； （4）机械强度高，韧性好。; 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1kb的DNA片段和DNA序列分析。其装载的样品量大，回收DNA纯度高。长度仅相差0.2%(即