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第二章 基因工程的酶学基础;核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。 ;　　　基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。;1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用 ; 限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。;2. 性质;;; 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。;（3）限制与修饰系统相关的三个基因;2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株 中， 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护. 2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点------（修饰）;3. 外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解 ------（限制）;1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用 ;1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下：;2. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。;3. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。 如Hind Ⅱ：d菌株中发现的第二个酶; ; 目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。 ;二、限制性内切酶的类型 　　 　　　据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。 ;首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。;需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）;　 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。 分离的第一个酶是Hind Ⅱ 　 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列），与DNA的来源无关。 ; 识别位点处。 切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如： ;; 在完全肯定的位点切割DNA(识别位点下游24-26bp)，但不是对称的回文顺序，且在识别序列旁边一定数目核苷酸的位置切割。 反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 ; IV型限制性内切酶 ;核酸限制性内切酶的类型及主要特性;;1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用 ;识别序列;1、以某一对核苷酸为中轴，左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补。 2、这两股DNA链若按同方向阅读（如5’ 3’），其核苷酸顺序相同。; 　　　Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’ 位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。 ;与II型核酸内切酶有关的几个概念;1. 5’突出的末端;2. 3’突出的末端;i）不同的DNA双链：;粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。;3. 平头末端;平齐末端的特点;不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。;Xma I 5’-C?CCGGG -3’ 3’-GGGCC?C-5’ Sma I 5’-CCC?GGG-3’ 3’-GGG?CCC-5’;识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等;5’-?GATC----3’ 3’----CTAG?-5’ ;1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用 ;1. 标准酶解体系的建立 ;2. 酶解过程;① 酶解体系;大部分II 型核酸内切酶需要相似的反