腺病毒介导的siRNA下调cMet表达抑制肝癌细胞生长的论文.docVIP

　　腺病毒介导的siRNA下调cMet表达抑制肝癌细胞生长的论文 【摘要】 目的 探讨重组腺病毒介导的sirna技术下调cmet表达对cmet过表达肝癌细胞在体外生长和成瘤性的影响。方法 用重组腺病毒介导的sirna技术下调cmet的表达；通过tt法和细胞计数法检测细胞的生长和增殖情况；以流式细胞术检测细胞周期变化情况；以软琼脂克隆形成实验考察细胞的克隆形成能力。结果 重组腺病毒介导的sirna可使hcclm3细胞cmet的表达量下调90%以上。下调cmet表达可使hcclm3细胞生长停留在g1/g0期，增殖速率下降30%以上；下调cmet表达可使hcclm3细胞克隆形成能力下降约78%（plt;0.01）。结论 重组腺病毒介导的sirna下调cmet表达具潜在的肝癌基因治疗价值。 【关键词】 cmet rna干扰 重组腺病毒 肝癌 cmet属肝细胞生长因子受体，在多种肿瘤中过表达，与肿瘤的发生和恶化密切相关[1]。我们及其他学者的研究表明cmet在30%～50%的肝癌病例中过表达[24]，肝癌伴有高cmet表达的患者5年生存率明显低于肝癌伴有cmet少量表达者[4]。人为在肝细胞内过表达cmet会导致cmet的配体非依赖性激活和细胞转化[5]。 虽然不少实验表明cmet过表达与肝癌的发生密切相关，但下调cmet表达对肝癌细胞生长有何影响尚不明确。.rna干扰是最近几年发展起来的一项新兴的抑制基因表达技术，其本质是通过长度为19～21个核苷酸的小干扰rna（small interfering rna, sirna），介导序列高度同源的靶基因的mrna降解，从而在基因转录后水平上下调（knock doet在hcclm3肝癌细胞中高表达[2,3]。本文拟利用重组腺病毒介导的sirna技术考察下调cmet表达对肝癌细胞hcclm3在体外生长的影响。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 穿梭质粒pshuttleh1由德国学者shen cx和reske sn惠赠，padeasy1腺病毒骨架质粒由美国学者he tc提供。胎牛血清为杭州四季青生物公司产品。核酸内切酶pacⅰ为neb公司产品。兔抗人cmet多克隆抗体为美国zymed公司产品。鼠抗人cyclin d1单克隆抗体为santa cruz公司产品。兔抗βactin多克隆抗体及ap标记羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。四甲基偶氮唑蓝（mtt）为sigma公司产品。 1.2 细胞培养 hcclm3肝癌细胞由上海肿瘤研究所惠赠，在37℃、含5% co2且湿度饱和的co2培养箱中用含10%胎牛血清的dmem培养基培养。 1.3 重组腺病毒载体的构建 从genbank中检索到cmet的cdna序列（登录号：nm_000245），用ambion公司网页上（/techlib/misc/ sirna_finder.html）提供的在线工具（sirna target finder）找出潜在的靶序列，再按sirna设计的一般原则选取靶序列。本实验选取的靶序列是5aacatggctctagttgtcgac3（正义），位于起始密码子下游349～369区。按照shen等[7]提供的方法将靶序列亚克隆进pshuttleh1产生pshuttleh1sirna/met，再参照he等[8]的方法将pshuttleh1sirna/met与病毒骨架质粒padeasy1在大肠杆菌bj5183中进行同源重组，提取重组病毒质粒，经pacⅰ酶切纯化后转染293a细胞包装出重组腺病毒adh1sirna/met，同时，用同样的方法以空载质粒pshuttleh1构建了重组空载腺病毒adh1null。 1.4 重组腺病毒对hcclm3细胞最适感染复数的测定 我们用表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒adcmv/gfp（本实验室贮存）来测定hcclm3细胞的最适感染复数（multiplicity of infection，moi）。hcclm3细胞接种于6孔板，生长至80%汇合度时，每孔分别加入已知病毒浓度的adcmv/gfp病毒液0.1、0.2、0.3、0.5、1和2μl。常规培养48h后，在倒置荧光显微镜下分别用可见光和荧光观察，统计表达gfp的细胞占总细胞数的百分比（感染效率），并根据孔内所加入的病毒数算出相应的moi。 1.5 mol/l tris，150.0 mmol/l nacl，0.1% sds，1.0% np40，1.0 mmol/l na3vo4，2.0mmol/l naf，100.0 μg/ml pmsf，1.0 μg/ml leupeptin和1.0 μg/ml aprotinin），冰浴30min，刮取细胞，12 00