蜂毒素诱导人成骨肉瘤细胞凋亡的机制探讨的论文.docVIP

　　蜂毒素诱导人成骨肉瘤细胞凋亡的机制探讨的论文 【关键词】 蜂毒素 蜂毒素是蜂毒的主要成分，具有多种生物学活性，近年来的研究揭示了其抗肿瘤作用，引起了人们的广泛关注，有研究显示蜂毒素对肝癌bel7402、smmc7721、hep3b［1,2］、t淋巴细胞白血病6tcem［3］等多种肿瘤细胞具有明显的增殖抑制及诱导凋亡作用，但目前蜂毒素诱导肿瘤细胞凋亡的机制还不十分清楚。本研究观察了蜂毒素对人骨肉瘤u2os细胞生长增殖抑制和诱导细胞凋亡的作用，探讨了线粒体膜电位及凋亡相关蛋白bcl2、bax表达变化，旨在探讨其诱导机制。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 化学试剂及蜂毒素 mem培养基、胎牛血清购自美国gibco公司，胰蛋白酶和rodamine123购自美国sigma公司，鼠抗人bcl2单克隆抗体及bax鼠抗人多克隆抗体购自santa cruz公司。蜂毒素由长海医院中医科实验室提取、纯化，用生理盐水配置成1mg/ml，-20℃冷冻保存备用。 1.1.2 细胞株和细胞培养 骨肉瘤u2os细胞株购自中国科学院上海细胞研究所，采用含10％胎牛血清的dmem完全培养基，在37℃、体积分数为5％co2、完全饱和湿度条件下常规培养，用0.25％胰蛋白酶和0.02％edta按1∶1混合的消化液消化细胞，2～3d进行传代培养，取对数生长期细胞进行实验。. 1.2 实验方法 1.2.1 mtt法测定细胞增殖抑制率及半数有效抑制浓度（ic50） 取对数生长期u2os细胞，以1×104/孔的密度接种于96孔板，常规培养，培养体系为100μl。培养24h细胞贴壁后，设对照组及实验组，每组设6个复孔，实验组分别加入终浓度为1、2、4、8、16和32μg/ml的蜂毒素分别作用12、24、36h。实验结束前4h每孔加入mtt 10μl（浓度为5mg/ml），终止实验时取出96孔板，弃上清，滤纸吸干浮液，每孔加dmso 150μl，充分溶解，置标仪上测定吸光度a值，测定波长为492nm，按以下公式计算生长抑制率： 抑制率＝（对照组a值-实验组a值）/对照组a值×100％ 应用药物抑制浓度计算软件（loggt法）计算ic50值。 1.2.2 透射电镜形态观察 作用12h后收集细胞，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，常规电镜标本制作，在h600型透射电镜下观察细胞超微结构。 1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 作用12h后，收集细胞并重悬于binding buffer（结合缓冲液）中，加荧光标记的annexin v和pi，室温避光孵育15min, 流式细胞仪检测细胞凋亡率。 1.2.4 流式细胞仪测定线粒体膜电位(δψm)的变化 作用12h后，消化、收集细胞。pbs洗2次，细胞重悬于0.5ml pbs中，加入rh123使其终浓度为10mg/ml。37℃避光孵育30min，pbs再洗1次，上流式细胞仪检测。 1.2.5 免疫细胞化学法检测bcl2和bax蛋白表达变化 取对数生长期u2os细胞，以2×105个/每孔接种预先置有盖玻片的无菌六孔培养板中，培养过夜后分别加入终浓度为2、4、8μg/ml的蜂毒素，另设无药物处理的空白对照组，继续培养12h，取出盖玻片，按bcl2和bax免疫组化试剂盒操作说明书进行染色、固定。bcl2和bax染色信号均为棕黄色，定位于细胞浆。结果判定方法为光镜下以细胞浆有明显棕黄色为阳性细胞。采用ims计算机细胞图像分析系统进行阳性表达强度的定量分析，光镜下（×250）随机选3个视野，通过预设采样程序得出阳性面积百分比（positive area rate）和平均光密度值（average od value），两者的乘积为免疫细胞化学阳性指数（positive index，pi）。 1.3 统计学方法 应用spss 11.0对实验数据进行分析，数据结果均采用±s表示，多组间比较先行方差齐性检验，方差齐者进行单因素方差分析，两两比较采用neankeuls检验（q检验）；方差不齐者进行成组秩和检验(kruskalenyi法。 2 结果 2.1 蜂毒素对骨肉瘤u2os细胞的生长抑制作用 loggt法测得ic50值为7.12μg/ml，在2～8μg/ml浓度范围内对u2os细胞增殖抑制作用具有明显的剂量和时间依赖性，见图1。 图1 蜂毒素对u2os细胞的生长抑制作用 fig 1 the inhibitive effect of melittin on u2os cell line 2.2 透射电镜形态观察 对照组骨肉瘤细胞染色质均匀分布，细胞核不规则呈多角形，个别细胞胞浆中含有脂滴。蜂毒素2μg/ml处理组细胞胞浆疏松，胞膜隐约可见，染色质边集，出现了典型的凋亡早期