血管内皮生长因子C反义脱氧寡核苷酸对肺癌细胞的作用的论文.docVIP

　　血管内皮生长因子C反义脱氧寡核苷酸对肺癌细胞的作用的论文 血管内皮生长因子c反义脱氧寡核苷酸对肺癌细胞的作用 【摘要】 　　目的 探讨非小细胞肺癌（nscc）中血管内皮生长因子c（vegfc）信使核糖核酸（mrna）的表达及其反义脱氧寡核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotide，asodn)对人肺癌细胞的作用。方法 应用原位杂交技术检测48例新鲜肺癌标本中vegfc mrna的表达，将脂质体介导的vegfc asodn转染人肺癌细胞株a549,用rna在肺鳞癌和腺癌细胞中的表达阳性率分别为65.4%（17/26）和59.1%（13/22），经vegfc asodn转染的细胞株a549中，vegfc蛋白表达水平明显下降（p＜0.01）。结论 vegfc mrna在nscc中有一定程度的表达，体外实验vegfc asodn通过下调vegfc蛋白的表达抑制肺癌细胞的侵袭作用。 【关键词】 血管内皮生长因子c;非小细胞肺癌；反义脱氧寡核苷酸 　　肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率增长最快、预后最差的恶性肿瘤之一，由于发病机制不清楚，死亡率颇高。虽然以手术为主的综合治疗近年来取得较大进步，但肺癌的生存率仍不甚理想，基因治疗成为目前研究的热点〔1〕。肺癌的淋巴转移是致死的一个重要原因，血管内皮生长因子c（vegfc）是特异性的淋巴管内皮细胞生长因子，其促肿瘤细胞生长和血管生成的作用已有较多报道〔1〕。.cOm但本研究采用原位杂交技术，从基因水平检测vegfc mrna的表达，并通过体外实验，用vegfc反义脱氧寡核苷酸（asodn）转染肺癌细胞株，研究vegfc蛋白的表达情况，为肺癌的基因治疗提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 标本和细胞株 　　原位杂交标本为本院胸外科2006年9月至2007年7月经手术切除的48例新鲜非小细胞肺癌（nscc）标本，其中鳞癌26例，腺癌22例；人肺癌细胞株a549购自中科院上海细胞所。 　　1.1.2 主要试剂 　　原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；寡核苷酸探针序列设计严格遵守分子杂交的原则，从genbank查出人vegfc的全长mrna序列，序列号为nm_005429.2，用dnastar软件的“探针与引物设计功能”从全长序列中筛选出符合探针条件的最佳序列，将其在人类基因文库中与其他序列对比，确保其特异性，由上海生工公司合成并直接在5′末端标记地高辛，其序列如下：5′tgtacaagtgtcagcaagg3′；正义脱氧寡核苷酸(sense oligodeoxyribonucleotide，sodn)、asodn由上海生物工程公司合成并硫代磷酸化修饰；阳离子脂质体lipofectamim2000(lip)购自美国invitrogen公司；rpmi1640培养液为gibco公司；matrigel、trans切片，备用。原位杂交步骤包括杂交前预处理、杂交、杂交后处理及5溴4氯3吲哚磷酸/氯化硝基四氮唑蓝（bcip/nbt）显色，阳性对照为人脑胶质母细胞瘤，阴性对照加不含探针的杂交液。原位杂交以胞浆中出现蓝紫色颗粒者判为阳性。 　　1.2.2 脂质体 　　寡核苷酸（odn）转染复合物和预处理 odns序列采用硫代硫酸型asodn序列为：5′aagaagcccagcaagtgcat3′;sodn序列为： 5′atgcacttgctgggcttctt3′。部分odns有荧光标记。按 invitrogen公司lipofectamim2000说明书，odn（μg)：脂质体(μl)=1∶2.5比例混合配制。根据转染复合物的类别分为4组：①空白对照组；②脂质体；③sodn组；④asodn组，终浓度1 333 ng/ml，荧光显微镜下观察转染30 min细胞内便有荧光标记的odns出现，随着时间延长，细胞内荧光越来越强，转染6～12 h细胞内荧光最强。转染率70％左右。转染48 h后收集细胞进行检测。 　　1.2.3 in，离心，取上清用紫外分光光度仪行蛋白定量，加入1/5体积的5×上样缓冲液，沸水煮沸5 min，以40 μl(64 μg)每道上样，10％十二烷基硫酸钠（sds）聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至nc膜，4℃封闭过夜，加入1∶250稀释的vegfc一抗，室温孵育2 h，tris缓冲液（tbst）洗3次，加入辣根过氧化物酶标记二抗(1∶2 000)孵育2 h，tbst洗3次，加ecl化学发光剂，x线片暗室曝光，常规显影、定影。将胶片用凝胶成像仪扫描入电脑,用quantity one4.4.0软件分析，得到所有条带的累积光密度值(iod)，计算目的条带与βactin累